生物化学第15章核酸的研究方法.ppt

第15章 核酸的研究方法 核酸的研究方法 1、核酸的分离、提纯和定量测定 一、DNA的分离： 真核生物中的染色体DNA常与碱性蛋白结合成核蛋白（DNP）形式存在于核内。 1）苯酚法： 用浓盐（1MNaCl）提取出DNP； 用稀盐（0.14MNaCl）沉淀出DNP； 用苯酚提取，除去蛋白质； 冷乙醇沉淀出DNA； 1、核酸的分离、提纯和定量测定 一、DNA的分离： 2）蛋白酶法： 细胞悬液中加入含1％SDS的缓冲溶液 加入蛋白酶K，65°C保温4h 苯酚抽提 乙醇沉淀 核酸的研究方法 核酸的研究方法 1、核酸的分离、提纯和定量测定 二、RNA的分离： 因为Rnase无处不在而得RNA提取分离更为困难。 制备RNA应注意： 1）、所有玻璃器具都应高温灭菌； 2）、破碎细胞时使用强变性剂，如胍盐，使酶失活； 3）、在RNA反应体系内加入RNA酶的抑制剂； 1、核酸的分离、提纯和定量测定 二、RNA的分离： 目前最常用的RNA制备方法有两个： 1）用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提：少量制备RNA。 2）用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心：大量制备RNA 核酸的研究方法 1、核酸的分离、提纯和定量测定 三、核酸含量的测定： 钼蓝比色法： 用浓硫酸或过氯酸将有机磷氧化成无机磷，在酸性条件下与钼酸生成磷钼酸，在还原剂存在下生成钼蓝，最大吸收在660nm处，从而可以比色测定。 核酸的研究方法 2、核酸的超速离心 应用超速离心技术，可以测定核酸的沉降常数和相对分子质量，其基本原理与测定蛋白质的相对分子质量相同。 分析DNA时，常用氯化铯密度梯度，密度梯度沉降平衡法常用于如下几个方面： 核酸密度测定 测定DNA中G-C的含量 溶液中核酸构象的研究 核酸的制备 核酸的研究方法 核酸的研究方法 密度梯度沉降平衡法 核酸的研究方法 3、核酸的凝胶电泳 核酸常用的电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可在水平电泳槽也可在垂直电泳槽内进行电泳。 以琼脂糖为支持物的电泳迁移率主要受下面因素影响： 1）核酸分子大小； 2）胶浓度； 3）DNA的构象； 4）电压； 5）碱基组成； 6）温度 3、核酸的凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同： 相同点： 基本操作相同 影响因素相同 不同点： 分离分子量大小不同 适用对象不同 灵敏度不同 电泳槽类型不同 核酸的研究方法 核酸的研究方法 4、核酸的核苷酸序列测定 （一）Sanger的酶法测序：反应体系包含单链模板、引物、四种dNTP和DNA聚合酶。共分4组，每组按一定比例加入少量2`,3`双脱氧核苷酸。 Frederick Sanger 核酸的研究方法 核酸的研究方法 核酸的研究方法 自动DNA序列分析仪 4、核酸的核苷酸序列测定 (二)DNA的化学法测序： 化学法的基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸。4种特异性反应有： G反应 G+A反应 T+C反应 C反应 核酸的研究方法 4、核酸的核苷酸序列测定 Walter Gilbert 核酸的研究方法 核酸的研究方法 毛细管阵列电泳 基本步骤： 设计引物 优化体系 选择热循环温度 鉴定扩增产物 核酸的研究方法 5、DNA聚合酶链反应（PCR） 6、DNA的化学合成 核酸的研究方法 核酸的研究方法 Questions CRISPR/Cas9技术原理及研究进展 RNAi技术原理及研究进展 ABI SOLiD sequencing Illumina (Solexa) sequencing 454 pyrosequencing