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第四章 细胞碎片与包含体产品的分离 4.1 细胞碎片的分离 4.2 包含体产品的分离 生物分离过程的一般流程 4.1 细胞碎片的分离 细胞破碎悬浮液中的固体颗粒包括： 细胞壁碎片、膜碎片、细胞器、包含体、完整细胞等。 颗粒尺寸范围：0.1~10μm，大多0.2-1.0 μm。 粘度：为细胞悬浮液的2~10倍。 ＊ 固液分离难度比发酵液困难得多! 4.1.1 离心沉降 离心机的基本要求： 分离因素( )大于5000 常用离心机： 管式离心机—最大分离因素可达50000以上 碟片式离心机—最大分离因素可达15000以上 离心沉降的特点： （1）可通过控制进料流量来达到所要求的分离目的。 如：碟片式离心机的最大允许流量为： ?? 式中：d —颗粒直径（m） ρS —固体颗粒密度（kg/m3） ρL —液体密度（kg/m3） μ— 液体粘度（kg/m.S） g —重力加速度（m/S2） ω—离心机的角转速（1/S） Z —离心机的特征常数 （2）投资高，能耗大。 4.1.2 微过滤（MF） MF孔径： 0.01~10μm 可截留颗粒直径： 0.02~10μm 特点： （1）设备投资少，能耗低，不受液固密度差的影响。 （2）分离效果影响因素较多，存在膜的泄漏与堵塞问题。 4.1.3 双水相萃取 一般萃取系统：有机相和水相 双水相萃取系统： 轻相—富含某种高分子化合物的水溶液 重相—富含盐类或另一种高分子化合物的水溶液 80年代开始用来分离生物大分子、细胞碎片和细胞蛋白质 可克服离心分离中投资高、能耗大的缺点，也不存在MF中膜的泄漏和堵塞问题。 4.1.4 泡沫分离法 一种基于悬浮液中的颗粒（或溶质）间表面活性的差异而进行分离的一种方法。 表面活性强的物质优先吸附于气相与液相的界面处（即气泡表面），被气泡带出而达到浓缩。 在生物领域，主要用于分离（收集或除去）细胞、细胞碎片、蛋白质和酶。 相对于离心与膜分离而言，泡沫分离更适合于低密度和低浓度悬浮物的分离与去除。 注意：蛋白质容易在气、液界面失活。 4.1.5 吸附分离 吸附分离的方式： （1）向细胞碎片悬浮液中加入固体吸附剂。 （2）流化床/固定床—用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的流化床或固定床。 （3）扩张床—床层中介质（吸附剂）处于松散状态，床层可上下浮动。综合了固定床和流化床的优点，克服了流化床的返混问题和固定床颗粒间隙的堵塞问题。 （4）膜吸附—将微孔膜进行处理，使之带有离子交换、亲和配基等吸附基团。这样液体中的溶解产物分子也可被膜吸附，加入适当的洗脱剂后即可分离出目的产物。于是，一步膜分离的效果相当于过滤、浓缩和吸附三步操作。 4.1.5 吸附分离 吸附分离的特点： （1）有可能回收液体中的全部产物。 （2）操作时间短，减少了产物受污染和降解的机会。 （3）在吸附的同时可除去大量液相杂质。 （4）设备简单，能耗低。 （5）合适的吸附剂较难选择，特别是当目的产物在液相时，要注意目的产物被吸附而损失。 外源蛋白在大肠杆菌中的积累 包含体（Inclusion bodies）—一种不具生物活性的蛋白产物。多为克隆表达产物，这些产物在一级结构上是完全正确的，但在高级结构上是错误的，因而不具生物活性。 包含体形成机理—外源蛋白质在合成过程中缺乏某些协助因子或周围环境不适，使其次级键（氢键等）的形成受影响，最终形成不具活性的包含体产品。 包含体的特性： (1)颗粒直径0.5~1.0μm，可在相差显微镜下观察到。 (2)外围全部被疏水基团包围，不溶于一般水溶液。 (3)质体坚硬，比重较大，适于离心分离，如采用高压匀浆则易造成匀浆阀的破坏。 包含体产品的提取与分离较复杂，回收率一般不超过20%。 4.2.1 包含体产品的一般分离过程 细胞破碎（不宜采用高压匀浆法） ↓ 分离出包含体 ↓ 溶解包含体 ↓ 目的产物构型复原（即复性） 具体工艺路线如下： 4.2.1 包含体产品的一般分离过程 （1）路线Ⅰ 4.2.1 包含体产品的一般分离过程 （2）路线Ⅱ 4.2.1 包含体产品的一般分离过程 （3）路线Ⅲ 4.2.3包含体的溶解 包含体可溶于变性剂溶液，如盐酸胍、脲等。 变性剂溶解机理：破坏高分子生物物质的所有氢键和疏水键，使疏水性物质变为亲水性物质。 变性液中的变性蛋白质—一级结构和共价键未被破坏，但没有正确的高级结构，同样