第五章 体内药物分析讲解.ppt

基质效应 当采用质谱方法时，应该考察基质效应。 使用至少6 批来自不同供体的空白基质，不应使用合并的基质。 对于每批基质，通过计算基质存在下的峰面积（空白基质提取后加入分析物和内标），与不含基质的相应峰面积（分析物和内标的纯溶液）比值，计算每一分析物和内标的基质因子。 已测样品再分析 当存在蛋白结合以及已知和未知代谢物的回复转化、样品均一性或同服药物引起的差异，可能影响样品在处理和储存过程中分析物的准确度和精密度时需要进行样品再分析。推荐通过在一定时间周期内重新分析试验样品，来评价实际样品测定的准确度。 推荐从几名受试者处获得样品进行再分析，接近预期的最大浓度及消除相浓度。样品不应合并。 * * * * * * * * * * * * * * * * * 实验步骤 第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 —除去大部分甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析 血浆样品可直接上柱，样品量0.1~2ml，流速1~2ml/min * 本法特点：少溶剂、少污染、减少液液萃取的乳化。适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制成水液方可进行固相萃取。 固相萃取特别适用于极性较大、水溶性较大、稳定性较差、不宜用过强的酸碱处理的药物。 柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。 用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是柱切换技术。 基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱上完成色谱分析。 自动化固相萃取-柱切换高效液相色谱法 3. 超滤法 膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药物浓度 按照分子截留量的大小，可分离30?1000kD的可溶性生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。 （三）、辍合物的水解： 酸水解法：强酸、加热 酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.5~5.5 ，37℃孵育数小时。 溶剂解： （四）、化学衍生化 1、使药物变成能被分析的性质 2、提高检测灵敏度 3、增强药物稳定性 4、提高对光学异构体分离的能力 气相色谱衍生化 液相色谱衍生化 衍生化方法：柱前衍生， 柱后衍生 气相色谱衍生化方法：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化 液相色谱衍生化方法：紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性衍生化 第三节、体内样品分析方法与方法验证 一、分析方法的建立 （一）、分析方法的选择 1、色谱分析法 2、免疫分析法 3、生物学方法 分析方法 检测限度/10-8g/ml 特异性/分离能力 紫外分光光度法（UV） 100 － 荧光分光光度法（Fluor） 0.1 ± 原子吸收分光光度法（AA） 0.1 + 气相色谱法 氢火焰离子化检测器（FID 1～10 ++ 氮磷检测器（N-PD） 0.1～0.01 +++ 电子捕获检测器（ECD） 0.01 +++ 质谱检测（MS） 0.001 ++++ 液相色谱法 紫外检测器（UV） 100 ++ 荧光检测器（Fluor） 0.1 +++ 电化学检测器（ECD） 0.01-0.001 +++ 质谱检测（MS） 0.001 ++++ 免疫法 0.001 ++ 常用分析方法 （二）、分析方法建立的一般程序 1、色谱条件的筛选：确定最佳分析检测条件；色谱柱(型号、牌号、填料性质、柱长度)；流动相组分及配比、流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等；使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)；良好的色谱参数(n、R、T)和适当的保留时间(tR)。 2、色谱条件的优化： 在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下： 空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 空白生物基质试验 —— 内源性物质干扰(方法特异性) 模拟生物样品试验 —— 方法验证（效能指标） 3、实际生物样品测试 二、分析方法的验证 1．特异性——避免干扰 2．标准曲线与线性范围 3．定量限——灵敏度 4．精密度与准确度——结果可重现 5．样品稳定性 6．提取回收率 7．分析过程的质量控制 准确度 精密度