高效液相色谱操作基础知识拓展浅析.ppt

高效液相色谱知识 一、液相色谱的原理 二、HPLC的特点 三、HPLC 的组成 四、流动相 五、缓冲溶液的作用 六、梯度洗脱的流动相调整 七、遇到问题的解决 八、气相与液相的区别 上海波粒仪器科技有限公司友情供 一、液相色谱的原理 原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出 。(反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来) 正相色谱：流动相使用非极性的疏水性溶剂（流动相极性＜固定相极性），常用于分离中等极性或极性较强的化合物（如酚类、胺类、酸基类及氨基类）;流出峰顺序为极性小的先流出。 反相色谱：流动相极性＞固定相极性；流出峰顺序为极性大的先流出 上海波粒仪器科技有限公司友情供 二、HPLC的特点 ①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。　　②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。　　③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。　　④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。　　⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 上海波粒仪器科技有限公司友情供 三、HPLC 的组成 HPLC系统一般由高压输液泵、进样器、OL Apple系列色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成 。 一、高压输液系统 1、泵的性能 ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。 2、梯度洗脱 上海波粒仪器科技有限公司友情供 三、HPLC 的组成 HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： 上海波粒仪器科技有限公司友情供 三、HPLC 的组成 ①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 ②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。 ③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 ④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡 上海波粒仪器科技有限公司友情供 三、HPLC 的组成 二、进样器 HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样 （我们是自动进样器） 注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤；②为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。 三、色谱柱 　实验室所用为OLC18柱（注：C18柱对PH要求比较严格，PH＝2－8之间。） 上海波粒仪器科技有限公司友情供 三、HPLC 的组成 在色谱