第十章高效液相色谱法范例.pptx

1 第十章 高效液相色谱法 2 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。 一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、特点 3 一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相、输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1~3cm，固定相粒径100μm 且不均匀 柱效低（H↑，n↓） 常压输送流动相 分析周期长 无法在线检测 2．HPLC：分离和分析 柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱） 柱效高（H↓，n↑） 高压输送流动相 分析时间大大缩短 可以在线检测 4 二、HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象、流动相、操作条件的差别 1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 5 2．流动相差别 GC： 流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 输送流动相压力为2~20MPa HPLC： 流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 输送流动相压力为0.1~0.5MPa 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 6 三、HPLC的特点和应用 “三高” “一快” “一广” 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物，广泛用于中药成分分离） 7 第一节 高效液相色谱仪 国产P600高效液相色谱仪 安捷伦1260高效液相色谱仪 8 高效液相色谱仪组成 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统 9 液相色谱流程图 10 一、高压输液系统 1、 贮液器 （1）作用：提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析工作。 （2）要求：①必须有足够的容积，以备重复分析时保证供液；②脱气方便；③能耐一定压力；④所用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。⑤配有溶剂过滤器 2、 脱气装置 （1）作用：防止流动相从高压柱流出时，释放气泡进入检测器而使噪音剧增。 （2）方法：①吹氦脱气 ②超声波脱气 ③真空脱气 12 3、 高压输液泵 关键部件之一。 （1）作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。 （2）要求： ①泵体材料能耐化学腐蚀；②能在高压（30～60MPa）下连续工作；③输出流量稳定（± 1%），无脉冲，重复性高（± 0.5%） ，而且输出流量范围宽；④适用于梯度洗脱。 （3）类型：恒压泵、恒流泵。 输液泵操作注意事项： 防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气 15 4、梯度洗脱装置 （1）作用：缩短时间，使各组分完全分离。 （2）类型： ①高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 ②低压梯度：一台高压泵, 通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 16 （二） 进样系统 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置。 17 进样方法 1.手动进样 18 进样方法 1.自动进样（自动进样器） 19 （三）分离系统 主要部件为色谱柱，一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 色谱柱及柱温箱 20 （四）检测系统 1、紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 ①可变波长紫外检测器（UVD） 适于：吸收紫外光的物质。 特点：灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm×10mm，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感