高温菌的纯种分离与鉴定范例.pptx

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高温菌的纯种分离与鉴定 汇报人:赵影 汇报内容 实验内容 实验结果及分析 实验后期工作 实验内容篇 接着上次的实验结果,老师给的样品{DSM88固体培养基,温度70度,PH7.0}培养长出了菌株 对菌株进行纯种分离 :在培养出的菌株中挑选了10个单菌落{从菌落特怔看为不同的菌种}进行培养,多次划线,直到长出的菌为纯种菌 对得到的10种菌进行斜面保藏及革兰染色观察它们的形态结构{对部分菌进行了芽孢染色} 实验结果篇 10种菌的菌落特征及形态结构(革兰染色,单染色) 2号菌革兰染色图片 2号菌单染色图片 3号菌革兰染色图片 3号菌单染色图片 4号菌革兰染色图片 4号菌单染色图片 5号菌革兰染色图片 5号菌单染色图片 6号菌革兰染色图片 6号菌单染色图片 7号菌革兰染色图片 7号菌单染色图片 8号菌革兰染色图片 8号菌单染色图片 9号菌革兰染色图片 9号菌单染色图片 10号菌革兰染色图片 10号菌单染色图片 实验结果分析篇 对挑取的9种样品进行多次重复划线 内容2 菌种的分子鉴定 细菌 的DNA提取: 实验原理:苯酚 氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性。SPS将细胞膜裂解,在蛋白酶K,EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,核蛋白变性降解,使DNA从核蛋白中游离出来,DNA溶于水,不溶于有机溶剂,蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液,当有机溶液存在时,蛋白质的这种胶体稳定遭到破坏,变性沉淀,离心后有机溶剂在试管底层(有机相),DNA存在于上层水相中,蛋白质则沉淀于两项之间,酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质,氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的溶液用2倍体积的无水乙醇在乙酸钠存在下沉淀DNA。回收DNA用70%乙醇法洗去DNA沉淀中的盐,真空干燥,用TE缓冲液溶解DNA备用。 内容2 实验步骤:1、挑米粒大小菌体+50微升溶菌酶+460微升1×TE,放入37℃摇床2小时以上(注意摇菌时离心管要横放) 2、20%SDS50微升+Pk5--10微升震荡混匀,放入55℃烘箱30~60min 3、550微升苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)震荡混匀,12000rPm离心10min,吸取上清(不吸到中间渣滓,反复抽提2次) 4、上清液+2倍上清液体积无水乙醇+0.1倍体积的乙酸钠,室温放置10min以上; 5、12000rPm离心10min,去上清,用70%乙醇轻摇洗盐1~2次,再次离心5min,弃乙醇 6、37~55℃干燥后(确保乙醇完全挥发干净,防止影响PCR),加水保存备用 50mi 加热使其溶解 定容 TE配制方法:(用于悬浮和贮存DNA) 配制100ml溶液各成分用量 1ml 1mol/L Tris-HCL (pH7.4-8 , 25℃) 200ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 水98.8ml Tris-HCL缓冲液配制: 将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中,再根据所要求的pH(25℃下)加一定量的浓盐酸,用水调至终体积1L 浓盐酸体积(ml) pH 70ml 7.4 60ml 7.6 42ml 8.0 0.5mol/LEDTA配制: 93.05gEDTA.Na2+10gNaOH 注:加固体NaoH调pH为8左右固体完全溶解。 20%SDS(50ml) 称取SDS固体10g加去离子水50mi 加热使其溶解 定容

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