73黄曲霉毒素测定.pptVIP

黄曲霉毒素的测定 黄曲霉毒素（Aflatoxins,简写AFT），是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒株的代谢产物，是一群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素，根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类，其中B大类在氧化铝薄层板上于紫外光下呈现蓝色荧光，而G大类则呈绿色荧光。 黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格规定。 AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严重。 黄曲霉毒素允许量标准 食品品种　　允许量标准（ppb或10-6） 玉米、花生、花生油　≤20 玉米及花生制品　　　≤20 大米、其他食用油　　≤10 裱花蛋糕、饼干、面包≤5 婴儿代乳食品　　　　不得检出 本章重点 薄层层析法测黄曲霉毒素 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年，它被列为AOAC(association of official agricultural chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。 原理 本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。 薄层色谱法黄曲霉毒素Bt的最低检出量为0．000 4ug，最低检出浓度为5ug／Kg。 仪器 小型粉碎机 样筛 电动振荡器 玻璃浓缩器 玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器 展开槽(25cm×6cm×4cm) 紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器 试剂 三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。 吸附剂－－硅胶 薄层层析用硅胶有多种规格。 应用最多的是掺有粘合剂石膏的硅胶，称有硅胶G，其掺入的石膏量为5-20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来，对层析的结果产生一定影响。 硅胶H――不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。 硅胶HF254 ――掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。 硅胶GF254――含石膏及荧光物质。 黄曲霉毒素B1标准溶液 1、黄曲霉毒素B1标准贮备液：准确称取1～1．2mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此标准液浓度约为10ug／mL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确10．0ug／mL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800 . 次氯酸钠溶液 配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g／L。 思考题： 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？ 消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。 2、为什么次氯酸钠溶液能起到消毒的作用？ 操作步骤 样品处理→提取 →浓缩→薄板制备→点样→展开→定量 (1)样品处理 样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至0．5～l kg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。 (2)提取 　　称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液。 　　　振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。 　　　取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。 浓缩 　　　将蒸发皿放在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确加入1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，再用此滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中。 　　注意：若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失。 测定－－单向展开法 1、薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2