第十四章免疫细胞的分离与检测素材.ppt

一、T细胞功能检测 Produce cytokines Cytotoxic action Mediate DTH T细胞的功能 T细胞功能检测试验 T细胞增殖试验 CTL介导的细胞毒试验 T细胞分泌功能检测 检测T细胞功能的体内试验 T细胞增殖试验 形态学法 3H-TdR掺入法 MTT比色法 CFSE标记染色法 形态学法 PBMC PHA/ConA 5％CO2 、 37℃培养72h 细胞涂片染色 显微镜检查 （五）免疫磁珠法 原理： 将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB） 加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应，形成抗体/抗原的复合物。 外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB 。 分法： 直接法 间接法 免疫磁珠法细胞分选过程 免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置 特点: 简便, 快速, 费用低, 无需特殊设备 全自动细胞分选仪 评价 高纯度（95％～99％） 高回收率（90％～95％） 高活性（99％～100％） 效果可与流式细胞仪媲美， 但更经济、省时、简便、快速 （六）流式细胞仪分选技术 经典方法： 离心 粘附法 补体细胞毒法 淘洗法 免疫磁珠法 经典分离方法的局限性 纯度 稀有细胞 ？ 高速 高纯度 高精度 流式细胞仪（FCM）具有高速、 高纯度、高精度优势。 激活细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。 Fluorescence activated cell sorter （FACS） 细胞分选 细胞分选（cell sorting）：有选择地从一个混合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。 四、吞噬细胞的分离 吞噬细胞种类 大吞噬细胞：单核细胞、巨噬细胞 小吞噬细胞：中性粒细胞 巨噬细胞：斑蝥敷贴法、腹腔渗出分离法、 中性粒细胞：右旋糖酐分离法、Ficoll－Hypaque分层液分离法 吞噬细胞分离法 斑蟊敷贴法分离人巨噬细胞 20世纪70年代由我国免疫学家创立 斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞 分离方法 腹腔渗出法分离腹腔巨噬细胞 腹腔注射诱导剂 3－4 days 腹腔内注射肝素PBS 处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞） 洗涤细胞、计数 3ml肝素抗凝全血＋1/4体积6％右旋糖酐生理盐水，室温静置30－40min，取上层白细胞，0.8％NH4Cl溶解红细胞，离心，取细胞沉淀用Ficoll－Hypaque分离液分离中性粒细胞和单个核细胞。 右旋糖酐法分离中性粒细胞 外周血中性粒细胞分离(Ficoll-Hypaque) 五、细胞活力检测 细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表示。 通常活力应＞95% 方法：苔盼蓝染色法 活细胞：不着色 死细胞：着色 白细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞和单核细胞的分离 淋巴细胞亚群分离 吞噬细胞的分离 小结：免疫细胞的分离与纯化 第二节 淋巴细胞的数量检测 T细胞数量检测 B细胞数量的检测 （一） 根据T细胞表面CD分子检测 间接荧光免疫法 免疫组织化学法：酶标、金标法 微量细胞毒试验 花环技术 一、T细胞数量检测 （二）根据T细胞受体检测 可溶性抗原肽-MHC四聚体复合法 Tetramer 1. 间接荧光免疫法 2. 免疫组织化学法： 酶标：ABC，APAAP 金标法 3. 微量细胞毒试验 针对淋巴细胞CD分子Ab与其相应的CD分子结合， 借助补体依赖的细胞毒作用，可造成表达特定表面Ag 的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内 ，使之着染红色，而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因 而不着色。计数着色细胞数,计算相应细胞的%。 微量细胞毒试验 淋巴细胞 抗CD分子单抗 补体 ＋ 伊红染色 细胞着色 4. 花环技术—E花环 总花环形成率（Et）： 4℃过夜，60%－80％ 活性花环形成率（Ea）： 室温低速短时离心，20－40％ E受体: CD2，表达于T细 胞、胸腺细胞、NK细胞 T cell SPA-IgG（anti-CD）-CD分子-T细胞亚群 4. 花环技术—葡萄球菌花环法 4. 花环技术—抗体致敏细胞花环法 SRBC-anti-CD-T细胞（CD分子） (三) 可溶性抗原肽-MHC四聚体复合物法 是一项近年发展起来的新技术 与FCM联合, 定量检测抗原特异性T淋巴细胞 1. mIg的检测: 酶免疫法、荧光免疫法 2. CD抗原检测 酶免疫组织化学法 间接荧光免疫法 流式细胞术 3. 受体检测（FcR、CR