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实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析
【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
【实验原理】
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下(大于0.7 M NaCl),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,最后经乙醇沉淀得到DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此,在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快,其次为线状DNA(L DNA),最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。
核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌环和嘧啶环的共轭双键,在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/m,ssDNA 33 μg/m和ssRNA 40 μg/m。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,若DNA的A260/A280比值高于2.0,则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。
【仪器】
离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪。
【实验步骤】
1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 ml EP管,在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。
2. 加入0.6 ml 2×CTAB提取液(用前加入0.2﹪的巯基乙醇),混匀,65℃ 水浴30 min,每10 min颠倒混匀一次。
3. 取出离心管,冷却后加入0.6 ml酚氯仿混合液,混匀。
4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次)。
5. 将上清液(约400 μl)转移到另一新的1.5 ml离心管中。
6. 加入与上清等体积的氯仿,混匀,11,500 rpm 离心8 min,取上清(约350 ul)。
7. 加入600 μl无水乙醇,上下颠倒混匀,-80℃放置30 min。
8. 4℃,15,800 rpm离心20 min,弃上清。
9. 1 ml 70%乙醇(预冷)洗涤沉淀2次,上下颠倒几次,不能Vertex,7,000 g离心3 min,弃上清,风干。
10. 加入30 μl无菌水(含20 μg/m RNase A),37℃ 溶解DNA 30 min。
11. 取5 μl DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测:
(1) 制备琼脂糖凝胶
称取0.24 g 琼脂糖,放入三角瓶中,加入30 ml 0.5× TBE缓冲液,置微波炉中加热至完全熔化,取出摇匀,则为0.8%琼脂糖凝胶液。
(2) 胶板的制备
① 取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙),形成一个模具。
② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并在固定位置放好样品梳子。
③ 待琼脂糖凝胶液冷却到60℃ 左右时,加入核酸染料1.5 μl,摇匀,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
④ 室温下静置直至凝胶完全凝固(室温下30-45 min),垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。
⑤ 加入0.5× TBE电泳缓冲液至电泳槽中,使缓冲液没过胶面约1 mm。
(3) 加样
在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。用10 μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面(注意:加样前要先记下加样的顺序)。
(4) 电泳
① 接通电泳槽与电泳仪的电源,DNA片段从负极(黑色插头)向正极(红色插头)移动)。DN
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