分子生物学实验-2013研讨.doc

实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/m，ssDNA 33 μg/m和ssRNA 40 μg/m。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器】 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪。 【实验步骤】 1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 ml EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2. 加入0.6 ml 2×CTAB提取液(用前加入0.2﹪的巯基乙醇)，混匀，65℃ 水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次。 3. 取出离心管，冷却后加入0.6 ml酚氯仿混合液，混匀。 4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次)。 5. 将上清液(约400 μl)转移到另一新的1.5 ml离心管中。 6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350 ul)。 7. 加入600 μl无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min。 8. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清。 9. 1 ml 70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能Vertex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干。 10. 加入30 μl无菌水(含20 μg/m RNase A)，37℃ 溶解DNA 30 min。 11. 取5 μl DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： (1) 制备琼脂糖凝胶 称取0.24 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 ml 0.5× TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为0.8％琼脂糖凝胶液。 (2) 胶板的制备 ① 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。 ② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③ 待琼脂糖凝胶液冷却到60℃ 左右时，加入核酸染料1.5 μl，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④ 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤ 加入0.5× TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm。 (3) 加样 在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。用10 μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 (4) 电泳 ① 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DN