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基因工程是指按照人们的意愿,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。
专题一 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具
(一)限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1.分布:
2.特点:
特异性,即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且切割每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,使之断开。
主要从原核生物中分离纯化出来
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
G
A A T T C
C C C G G G
G G G C C C
C C C
G G G
G G G
C C C
︰ ︰ ︰
中轴线
︰ ︰ ︰
↓
↑
EcoRⅠ
(在G与A之间切割)
SmaⅠ
(在G与C之间切割)
粘性末端
平末端
切割DNA分子产生的两种不同的末端(箭头表示酶的切割位点)
↓
↑
3.结果:
在识别序列中轴线两侧切割,产生粘性末端;在识别序列中轴线处切割,产生平末端。
(二)DNA连接酶——“分子缝合针”
(二)DNA连接酶——“分子缝合针”
(二)DNA连接酶——“分子缝合针”
2.连接酶的部位:
磷酸二酯键,不是氢键
1.连接酶的作用:
将互补配对的两个黏性末端连接起来,使之成为一个完整的DNA分子
3.连接酶的类型(按来源分类)
(1)E.coli DNA连接酶:
(来源于大肠杆菌)
只能连接双链DNA片段互补的粘性末端
(2) T4 DNA连接酶:
(来源于T4噬菌体)
既可以连接双链DNA片段 互补的粘性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端
(三)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用:
2.条件:
能在宿主细胞内复制并稳定地保存;
具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入;
具有标记基因,便于筛选;
必需是安全的,对宿主细胞无害。
将外源基因送入受体细胞
3.种类:
质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
质粒
细菌拟核DNA之外能自主复制的小型双链环状DNA分子;
DNA分子上具有多个限制酶切割位点;
只能在宿主细胞中进行自我复制;
DNA分子上具有特殊的标记基因;
对宿主细胞无影响。
二、基因工程的基本操作程序
获取目的基因
构建表达载体
导入受体细胞
目的基因检测与鉴定
第一步
第二步
第三步
第四步
(一)目的基因的获取
1.从基因文库中获取目的基因
(1)基因组文库
将含有某种生物不同基因的许多片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。
受体菌包含了某种生物所有的基因,该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。
(2)部分基因文库
受体菌包含了一种生物部分基因,该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库,如cDNA文库。
(3)基因文库的构建
基因组文库的构建
提取某生物
全部DNA
用适当
限制酶切割
许 多
DNA片段
与载体连接
导入受体菌群
该生物基
因组文库
(每个受体菌含有一段不同的DNA片段)
cDNA文库的构建——mRNA反转录形成
mRNA
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
与载体连接
导入受体菌群
该生物
cDNA文库
2.利用PCR技术扩增目的基因
(1) 原理
PCR是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),它是利用DNA 双链复制的原理,将基因的核苷酸序列不断的加以复制,使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行,所以又叫做体外DNA扩增技术。
(2) 过程
高温变性(90~95℃)
低温退火(55~60℃)
中温延伸(70~75℃)
双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的,因此整个
过程不需要解旋酶。
多次重复
(3)特点:指数形式扩增
推测
推测
合成
3.通过DNA合成仪直接合成目的基因
蛋白质的氨基酸顺序
mRAN
核苷酸序列
基因DNA的核苷酸序列
目的
基因
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时,可采用此种方法。
(二)基因表达载体的构建
用限制酶切割质粒使之出现一个切口,将目的基因插入切口处,让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后,在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子,即基因表达载体。
质粒
目的基因
限制酶
(二)基因表达载体的构建
1.构建目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。
2.构建零件及其作用
(1)目的基因
(2)启动子 RN
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