第八章分子标记及其应用研讨.doc

第八章 分子标记及其应用 分子标记的种类与特点 1. 遗传标记的种类与特点 遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。 Minisatellites：小卫星序列 遗传标记的种类与特点 1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。 2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。 3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。 4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。 2. DNA分子标记 DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。 2.1 分子标记的优点 1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限； 2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制; 3）多态性高，自然存在，无须专门创造； 4）表现为“中性”，即不影响性状的表达； 5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。 2.2 分子标记的类型 分三大类: 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段长度多态性 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等 基于DNA测序: 第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等 第三节 分子标记的应用 1. RFLP标记 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。 基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。 关键因素： 限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。 探针：常用单拷贝或低拷贝 gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。 RFLP标记的优缺点 优点： 1）共显性； 2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座； 缺点： 1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针； 2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。 2. RAPD 标记 RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。1990年提出。 基本原理: 单引物PCR标记 ；不同基因组DNA在随机引物Arbitary primer （8~10bp2个结合位点之间的距离可能不同，导致扩增片段数目和长度不同，经电泳分离显示出来，反映基因组相应区域DNA的多态性。 步骤：退火温度36℃左右，其余同普通PCR。 RAPD 标记的优缺点 优点： 1）简单快速，模板用量少，无需同位素； 2）无需基因组序列信息，引物通用； 3）成本低。 缺点： 1）显性标记，不能鉴别杂合子与纯合子； 2）稳定性和重复性较差；受很多因素影响： 退火延伸温度，模板浓度，Mg2+浓度，试剂污染，应舍重复 3）序列不同但长度相同的片段共迁移，使多态性检测受限制.只能分开片段长度不同的dna片段，对于长度相同但碱基组成不同的就分不出来 3. AFLP标记 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)：扩增片段长度多态性，1992 年提出，RFLP与PCR相结合的产物。 基本原理: 基因组DNA限制酶切（1种为常见6碱基切点，另1种为4碱基稀有识别位点，常为EcoRI（6）/MseI（4） ），酶切后DNA片段连接双链人工接头（14~18bp，核心顺序+限制酶识别序列，随机设计 ），以接头和相邻的限制酶位点作为引物结合位点，进行 双引物PCR扩增，产物用高分辨力测序胶分离。此多态性主要来自引物3`端选择性核苷酸的变化。 AFLP关键技术：引物的设计与组合。 引物由三部分组成: 1) 5`端与人工接头互补; 2) 中间部分与限制酶识别位点互补; 3) 3`端为1~3个选择性核苷酸。 AFLP 图谱 常用2~3个选择性碱基，每个泳道50~100条带 AFLP标记的优缺点 优点： 1）兼具PCR的高效性与RFLP的准确性； 2）常扩增50~100条带，多态性高，信息量大； 3）通过设计不同接头就可得到不同的引物，无需基因组序列信