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基因编辑技术和原理 李傲 什么是基因编辑技术? 基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术,可以精确地定位到基因组的某一位点上, 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变, 又修改并编辑了原有的基因组, 真正达成了“编辑基因”。 基因编辑的研究背景 传统的动物育种方法受到种源的限制,其程需要耗费大量的人力、物力和财力,经历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难,育种成果很难取得突破性进展。 基因编辑原理 现代基因组编辑技术的基本原理是相同的,即借助特异性 DNA 双链断裂激活细胞天然的修复机制,包括非同源末端连接和同源重组修复 两条途径。 1.非同源末端连接(NHEJ )是一种低保真度的修复过程,断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失,造成移码突变使基因失活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在,NHEJ 机制会将其连入双链断裂DSB 位点,从而实现定点的基因敲入。 ( 移码突变:在正常DNA分子中,碱基缺失或增加3的倍数,造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变,这种现象称移码突变。) 2. 同源重组修复(HR) 是一种相对高保真度的修复过程,在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下,供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点,不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB,在一个同源供体存在的情况下,可以进行原基因的替换。 基因编辑原理 基因编辑技术的种类 目前主要有 3 种基因编辑技术, 分别为: 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases,ZFN)技术; 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases,TALEN)技术; RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(CRISPR- Cas 9)。 1. ZFN 基因组编辑技术 ZFN 技术是第一代基因组编辑技术,其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块,到1996年,Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年,Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列,由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。 ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中,由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合,而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能,两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是, 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰,而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变,因此达到基因敲除的目的。 ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点,具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN, 需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性,但仍然存在不同程度的脱靶效应。 2. TALEN 基因组编辑技术 2009 年,研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活子样效应因子,它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。随后,TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强,不受上下游序列影响,具备比ZFN 更广阔的应用潜力。 TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点, 另一个则靶向
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