聚合酶链式反应幻灯片.pptVIP

实验七 聚合酶链式反应（PCR）技术 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论 实验目的 掌握PCR反应的原理及技术。 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 反应分为三步： 1.变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA； 2.退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链； 3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~106~7个拷贝。 PCR技术的参数主要有7个： 聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。 实验仪器、材料与试剂 （一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 （二）材料 模板DNA （三）试剂 1. 10x PCR buffer 2. dNTPs 2.5mM 3. Taq 酶 5u/μl 4. 引物1和2( 2μmol/L) (T3,T7) 5. 模板 实验步骤 1. 在0.2ml Eppendorf管内配制50μl反应体系 ddH2O： 33.5ul 10x PCR buffer： 5ul dNTPs（2.5mM）： 4ul 引物1 (2uM)： 1ul 引物2 (2uM)： 1ul MgCl2 3ul Taq 酶： 0.5ul 模板： 2ul 共50ul 体系 2. 按下述循环程序进行扩增 94℃ 5分钟，1个循环； 94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环； 72℃ 延伸10 分钟。 4℃保温。 3. 扩增结束后取50μl扩增产物，利用琼脂糖电泳检测DNA扩增情况,并切胶用于回收. 实验结果与讨论 PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的机会，以免出现目的条带以外的杂带。 如退火温度过低，也可能出现杂带。 PCR引物设计 长度：互补序列大于20，没有上限。 两引物具有较好的协调性； 内部二级结构较少； 加酶切位点时需要注意保护碱基长度； 检测特异性； 大引物与定点突变。 制品说明 本试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需30分钟便可完成。 使用本试剂盒每次可纯化得到多至10 mg的DNA片段（100 bp～30 kbp)，回收率高达50 ～80％。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。 每次处理的胶块量约为300 mg时，本试剂盒可使用50次。 运输、保存温度 室温。DR-II Buffer若出现沉淀，请于70℃保温溶解，待恢复至室温后使用。 * * PCR：变性－退火－延伸 PCR (c) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶DNA的扩增 (a) 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 3‘端绝对不能互补；