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无菌、微生物限度检查及方法验证要点 菌种、培养基、实验室环境管理 无菌检查及方法验证 微生物限度检查及方法验证 2010年版药典增修订情况 菌（毒种）管理办法 1. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全（烈性菌种双人双锁）。保管人员变动时，必须严格交接手续。 2.实验用菌种均从CMCC购置。菌种的申购，由保管人根据菌种保存情况，提出申购，经上级负责人签字批准。申购单应注明菌种名称、菌号、数量及请购人。从指定单位购到菌种后，应逐一核对菌种名称、菌号、数量，无误后方可接种，应做好记录。 3.菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能，并注明使用、转移、销毁情况及原因。 4.菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 5.各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换。 所有存在菌种应具备清单。 保存的菌、毒种传代或冻干均应填写专用记录，菌种管上应有牢固的标签，标明菌种编号、代次、批号、日期 培养、在药品微生物检查时，可进行简单的染色镜检，以保证在试验中所用菌种的正确。 致病菌与普通菌种要分开管理。 保存的菌种传代、移种后，销毁原菌种之前，应仔细检查新旧菌种的标签是否正确。 菌种的分类 三类：仅具一般性危险，能引起实验室感染的机会较少，一般的微生物学实验室采用一般实验技术能控制感染或有对其有效的免疫预防方法的菌种。 四类：生物制品、菌苗、疫苗生产用各种减毒、弱毒菌种及不属于上述一、二、三类的各种低致病性的微生物菌种。 微生物与生物安全实验室适用级别 二级生物安全实验室（BSL-2）： 登革热病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒等。 脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、军团菌、白喉棒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、非典型结核分枝杆菌等。 钩端螺旋体、致病性支原体、鹦鹉热衣原体、放线菌、青霉菌等。 验证实验常用菌种 枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（F）98001] 黑曲霉 [CMCC（F）9 003] 细菌室消毒隔离措施 1.每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒。 2.非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 3.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。 4.试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡（至少24小时以上）后清洗或丢弃。 5.所有微生物培养物（细菌、支原体、真菌等培养物），不管标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。 染菌物出 试验时及试验后将染菌/带菌物品放于盛有0.1％的苯扎溴铵溶液的灭菌专用桶中浸泡。 灭菌专用桶加盖，送集中洗涤室热压灭菌。将灭菌桶在121℃30min的条件下进行高压湿热灭菌，灭菌后再取出清洗。 高压蒸汽灭菌效果验证 菌种保藏步骤 ①干燥菌种复苏，划平板 ②挑选特征典型的纯菌菌落；（制菌悬液使用） ③确定保藏的合适菌体形态； ④选择最适宜的保藏方法，定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。 琼脂斜面低温保存法（厂家常用） 方法：将典型菌落接种在斜面（特殊菌种可用液体培养基）上，按规定培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月移种一次。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年 ~ 一年。 适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。 优点:简便，对大多数微生物都适用。 缺点:保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。 冷冻真空干燥保藏法 主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶形细致，不致损伤活菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在很长时间内菌种仍可维持活力不变。 试验