4蛋白质分子生物学改造及表达.pptVIP

蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除使蛋白质化学(一级)结构的发生改变的过程。 非必需部分的修饰：不影响蛋白质的生物活性。 必需部分的修饰：影响蛋白质的生物活性 。 影响蛋白质化学修饰反应的主要因素有两方面： 蛋白质功能基的反应活性； 修饰剂的反应活性； 化学修饰反应的主要类型： 酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应 主要对巯基、氨基和羧基等侧链进行修饰  PCR反应 在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、四种脱氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs）、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。模板DNA94℃变性1 min，引物与模板40～60℃退火1 min，72℃延伸2 min 扩增条件：94℃60 s,37℃60 s,72℃120 s,共25～30个循环。 Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10 mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。 GFP的不同颜色 Green-GFP blue-BFP：蓝色荧光蛋白 Cyan-CFP ：深蓝色荧光蛋白 Red-RFP：红色荧光蛋白 Yellow-YFP：黄色荧光蛋白 易错PCR（Error prone PCR）是一种相对简单、快速、廉价的随机突变方法。它通过改变PCR反应条件，如降低一种dNTP的量（降至5%-10%）、以dITP来代替被减少的dNTP、增加Mn++和Mg++的浓度或使用低保真度的DNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。 单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片段，具有互补3，末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的PCR在不同模板上随机互补结合，最后利用基因两端的序列为引物合成全长重排产物。 突变体的筛选 表型观察选择 在鉴定平板上产生的水解圈或变色圈 在微量滴定板上培养并测定酶活 自动酶标分析仪大大提高筛选的速度 高通量筛选方法：表面展示技术，酵母双杂交系统 三、基因的融合 采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白。 构建融合蛋白的基本原则是：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达。 为蛋白质的表达和纯化提供方便 与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白 与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST 蛋白表达的空间定位：信号肽 蛋白质结构和功能的研究 获得蛋白质的途径（通过体外切割） （一）基因融合的策略 1. 基因融合的方式 信号肽+基因 信号肽+基因+插入序列 2. 融合蛋白接头设计和选择 将2个或多个不同的模块连接成为一个大分子，其中起连接作用的氨基酸链即为linker，Linker的长度一般是在10-15个氨基酸之间。 若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原。 应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠有重大影响。 另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等） (GGGGS)3 (SG)5 蛋白纯化 蛋白质的检测和定向固定 提高重组蛋白质的产量 增强重组蛋白质的可溶性及稳定性 （三）融合蛋白报告分子 将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选。 作为报告分子必须具备以下特点： 1报告分子应不存在于宿主中且易于和内源性基因相区别； 2 应该有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子； 3报告分子的分析结果应具有很宽的线形范围，以便于分析启动子活性的幅度变化； 4报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动。 （四）蛋白质剪接-内含肽 自1998年发展起来的一种新的蛋白质工程技术称为“表达蛋白连接”或“内含肽介导的蛋白连接”。通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可以生物合成C端带有硫酯键或N端带有半胱氨酸的蛋白质分子。 两种蛋白质混合以后，硫酯键和半胱氨酸利用自然化学连接原理进行自发连接反应，硫酯键和半胱氨酸间直接形成肽健，从而将两种蛋白质连接起来。 自然化学连接是从蛋白质半合成研究中发展起来的技术，其基本原理是：C端带有α-硫酯