斑点叉尾鱼回一株新致病菌的分离鉴定及系统发育分析.pdf

第27卷增刊 内 蒙 古农业 大学 学 报 Vol2702S 2005年7月 J11l2005 ofInner Journal Mon901iaAgriclllturalUmversity 文章编号：1009—3575(2005)02S一叭42—02 斑点叉尾鲴一株新致病菌的分离 鉴定及系统发育分析+ A IDENTIFICATIONOFNEWPATHoGEN INICTAIURUSPUNCTATUS 耿毅。汪开毓，陈德芳。黄小丽 (四川农业大学动物科技学院，雅安625014) 近几年来在四JrI、重庆等地发生了一种斑点叉尾鲴急性流行性传染病，以病鱼体表出现圆形或椭圆形的 褪色斑，腹水、肠炎和后肠的肠套叠为病变特征，尤其是后肠的肠套叠的病变在目前所报道的斑点叉尾鲴疾 病中是极其罕见的。该病具有发病突然，死亡率高，传染快等特点，已给当地的斑点叉尾鲴养殖带来严重的 rDNA 经济损失。本研究从发病鱼体内分离到一株高致病性的病原菌，并采用传统的细菌表型特征以及16S 序列分析构建系统发育树等方法，对该茵进行了分类鉴定。 1材料与方法 1．1材料 试验鱼：病鱼采自四川龙泉湖斑点叉尾鲴养殖场；培养基、普通营养琼脂、TSA、TSB和兔血营养琼脂按 DNA聚合酶购自大连宝生物公 常规方法自制；细菌生化微量鉴定管购自杭州天和生物试剂有限公司。Taq 司，PCR引物由上海博亚生物有限公司合成。 1．2方法 1．2．1病原菌分离无菌从病鱼肝、肾取样划线接种于普通营养琼脂平板和兔血营养琼脂平板置于28℃ 培养24h，挑取单个优势茵落在TSA平板上再次划线，获得纯培养的CCFB0024菌株。 比浊管调整细菌浓度为1 尾鱼腹腔接种0．5ml菌液；另外1组作为对照组每尾鱼注射0．5ml无菌生理盐水。 1．2．316S rDNA序列测定与系统发育分析，参照有关方法进行。 2结果 2．1人工感染试验 试验组斑点叉尾蛔在接种感染后8h，斑点叉尾如表现为游动无力，呼吸缓慢，并逐步出现头向上．尾向 常。死亡的斑点叉尾鲴表现为口腔周围、下颌、腹部等充血、出血，腹部膨大，肛门红肿，剖解可见腹腔内有淡 黄色或带血的腹水，胃内充满大量浓稠的粘液，胃黏膜充血，出血；肠壁变薄，肠腔内充有大量淡黄色或含血 的液体，肠黏膜充血、出血，并于中后肠出现1～2个肠套叠，与自然发病斑点叉尾龃症状和病变相似。并从 *收蔫日期：2005—06—20 增刊 耿毅等： 斑点叉尾鱼目一株新致病菌的分离鉴定及系统发育分析 143 性传染病的病原茵。 2．2形态特征 呈灰白色，圆形，表面光滑，边沿整齐的半透明菌落；在TSA平板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径0． 8mm--1．2mm的透明的无色菌落；在兔血平板上出现明显的8溶血环，且溶血环呈草绿色。 23生理生化特征 温度为25℃～30℃，在含盐量5％以下的培养基上能生长，生长的pH范围为5．0～90最适pH为6．0～7． 0，其他的生理生化特征见表I。 表1 CCFB0024菌株的生理生化特征 2．4 16S rDNA的PCR扩增结果与系统发育分析 rDNA片段约1 PCR扩增出CCFB0024菌株的16S 养单胞菌属的细菌，再将获得的序列与Genbank中已报道的16S 高的序列和嗜麦芽寡养单胞菌属内相关菌株的16S 支，结合形态学和理化