斑马鱼作为抗肿瘤海洋药物研究模型Ⅰ胸腺苷酸合成酶基因的克隆表达.pdf

福建In 第三届海洋生物高技术论坛 200s．08．19．23 斑马鱼作为抗肿瘤海洋药物研究模型： I，胸腺苷酸合成酶基因的克隆表达 在必矿1’2学荣丽1 承培笋1 林旁矽n (1中国科学院海洋研究所，青岛266071) 00039) (2中国科学院研究生院，北京1 摘要胸腺苷酸合成酶(Thymidylate dTMP再进一步转化为dTTP，后者是DNA合成的重要前体，多年来Ts一直作为癌症化疗 的一个重要靶点，斑马鱼作为一种重要的模式生物，已成功用于多种药物筛选模型的构建， 但斑马鱼TS的基因序列与功能尚未见报道。本研究采用RT．PCR和RACE方法，从斑马鱼 胚胎中克隆出TS的cDNA全长序列，分析表明它的编码序列含有954个核苷酸，编码一个 318个氨基酸的蛋白序列，分子量为36kD。为了研究斑马鱼TS蛋白的性质，将该cDNA 诱导表达，纯化后获得了高纯度的均一性TS蛋白。酶学分析表明斑马鱼Ts蛋白在28℃表现 出比较高的生物活性，Km值与人等生物的TS蛋白比较接近。 关键词：斑马鱼，胸腺苷酸合成酶，克隆表达，催化活性 0引言 胸腺苷酸合成酶(TS)是一种叶酸依赖性酶，它催化dUMP和甲基化四氢叶酸生成dTMP 过胸腺苷酸激酶催化的拯救途径获得，但TS催化反应是dTMP细胞内从头合成的唯一来源 [2-4]。考虑到它在DNA生物合成的中心作用，抑制这一反应会导致细胞生长发育的停滞，TS 成为癌症化疗的一个重要靶点【5，6】。斑马鱼是一种非常好的模式生物，它适合用于遗传学、胚 胎学、发育生物学和细胞生物学的研究【．卜91。斑马鱼胚胎作为研究材料有很多优点，包括容易 保存和进行药物处理，胚胎体外受精，胚体透明，且发育速度比较快【lm比]。 现在20多种生物的TS基因已经克隆测序，其中一些TS蛋白的空间结构已通过X一射线 进行鉴定。我们前期的研究表明人和大肠杆菌的TS基因的表达调控是多水平控制的，包括 转录水平、翻译水平和翻译后水平，然而对鱼类的TS的调控机制却知之甚少。我们正在利 用斑马鱼作为抗癌药物筛选的模式生物，以发展新的TS表达抑制剂。在本研究中，我们克 隆了斑马鱼Ts全长cDNA序列，与大肠杆菌、小鼠和人的Ts序列进行了比较。我们还将 斑马鱼的TS基因在肠杆大菌中进行表达，并对表达产物进行了分离纯化、活性鉴定以及酶 学性质研究。 } 通讯作者：Email：linxiukun@yahoo．corn 730 藕建曩n 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19-23 1材料与方法 1。1材料 斑马鱼在本实验室饲养，大肠杆菌BL21(DE3)为实验室保存，反转录酶和DNA聚合酶购自 SMARTRACE克隆试剂 取试剂盒及PCR纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，CLOTECH 盒购自CLOTECH公司，测序由上海博亚生物公司完成，pET-28a为Novagen公司产品。 1．2RT-PCR中eDNA第一链的合成 总RNA从斑马鱼胚胎中提取。总RNA 样得到cDNA第一链作为模板，进行PCR反应。 1．3克隆斑马鱼TSeDNA序列 根据人和大肠杆菌TS的保守序列设计～对兼并引物，引物序列如下： 正义引物：5’．GTTI：ATGGYTrYCARTGG一3’： 反义引物：5-GGCRATGTTGAANGGRAC-3’。 SMART (R代表嘌呤，N代表核昔酸，Y代表嘧啶。)利用CLOTECHRACE克隆试剂 盒，通过5-RACE和3-RACE来获得斑马鱼TScDNA序列的两个末端，应用的特异序列 PCR引物如下： 正义引物：5’一GGCATTITGGAGCCGAATAC一3’； 反义引物：5’一GAGACCGATGTCTCCCGATC．3’。 1．4TS表达载体的构建 据已测序确定的斑马鱼TScDNA和表达载体pE