新型固定化pH梯度毛细管等电聚焦方法用于蛋白分离.pdf

B46新型固定化pH梯度毛细管等电聚焦方法用于蛋白分离 谢瑶尹开吉罗爱芹屈锋邓玉林砩 北京理工大学生命科学与技术学院北京100081 等电聚焦…(isoelectric isoelectric 电泳技术。Hjenen和Zhu[2]首次报道了在毛细管内进行等电聚焦(capillaryfocusing， 行等电聚焦必须添加较高浓度的两性电解质(CAs)以形成等电聚焦所必须的pH梯度。由于 CAs本身是十分复杂的混合物，并且具有较强的紫外吸收，所以使用CAs会带来重现性差， 不稳定及检测灵敏度降低的等缺点。通过其它方法‘5川，如：电解水、热致pH梯度、流体聚 焦等进行等电聚焦的技术也有报道，但大多存在所需仪器设备复杂、分辨率低、过程复杂等 缺点。 本文建立了一种新型的固定化pH梯度的方法，通过双官能团试剂异氰酸酯，将两性电解质 与毛细管壁耦联，并在处理后的毛细管中对两性电解质(CAs，pH3．10)进行等电聚焦，使得 CAs在毛细管内按等电点不同依次分开，并进一步通过CAs与双官能团试剂的化学键合，将 CAs固定在毛细管内壁。实验中采用聚丙烯酰胺涂层毛细管和固定CAs毛细管连接后进行等 电聚焦。并采用微流机械泵驱动毛细管内的聚焦区带，通过调节泵的流量，调节聚焦区带的迁移 semm 牛血清白蛋白(bovinealbumin，BSA)两种蛋白质混合物进行分离，证明了该方法可行。由 实验结果可知，该方法进行等电聚焦，蛋白质可以得到较好的分离且重现性好，分离结果如 图1。 2通讯作者： Tel；010 E-maih deng@biLedu．cn oftbemixture andBSA F豫．1ElectropherogramofhemoglobinseparatedbyClEF 5 u p∥rIlL)andBSA(7 CohmnforCIEF：lOO¨lll(id)×105cm；voltage：20kv／20s．H∞aoglobin(6 20mmol／LNaOH；anolyteforCLEF：20mmol／LH3P04；buffer：20mmolPBS pH=7qdetectionwaveleagth：254nmPeeks：1．Hemoglobin， 2BSA． 由于聚焦时不用再向缓冲溶液中添加两性电解质，避免了自由溶液聚焦时两性电解质所 带来的影响，故可以自由的选择所需要的最大吸收波长，得到较高的灵敏度。采用聚丙烯酰 胺涂层毛细管与CAs固定毛细管的偶联，不仅可以避免碱性蛋白的吸附，而且还可以使得等 电点在pH3—10的蛋白质能有效的被检测到，拓宽了有效检测范围。这种新型固定化pH梯度 毛细管等电聚焦的方法不仅可以应用在蛋白质的分离．而且在蛋白质样品的富集、多维毛细 管电泳以及与质谱的连用技术等领域也将有较好的应用前景。 关键词：毛细管等电聚焦；固定化pH梯度；蛋白分离；化学键合 参考文献 【l】傅若农．色谱分析概论．J匕京：化学工业出版杜，1999 [2lHjeften S．．2加MD，Chromatogr,1985；346：265 【3]MazzeoJR．，KsullI．S．AnalChem．1991，63：2852 【4】S．Martinovie，LPaaa-Tolic，C．Masselon．PKJensen，C，LStone，RD 2000(21)：2368 Smith．Electrophoresis 15]RilbeH．Steady-staterheoeleclrolysis^Chromatogr．1778,159：193—205 J Anal Chem．2000，72：4758—4761． 【6]Huangt．WuX．-Z．，P