新型番鸭细小病毒VP1基因序列测定与分析.pdf

392 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 新型番鸭细小病毒VPI基因序列测定与分析+ 徐昌领1，陈芳艳2。赵赣3，陈庆华’，王林川1- (华南农业大学 1兽医学院，2动物科学院．3生物技术学院，广东广州510642) 摘要：从中国广东某番鸭场分离到一株病毒，该病毒可以引起雏番鸭典型的“自点病”临康症状和病 理变化，进行初步鉴定为细小病毒。为了进一步鉴定该病毒，笔者对谊病毒的全部功能性基因进行了扩增， 并与GeneBank中发表的番鸭细小病毒以及小鹅瘟细小病毒所有vPl基因进行核苷酸以及核苷酸推导的氨基酸 序列匣裸性进行分析以及系统进化树分析。分抚坫果表明：分离蝽与所有参妃序列的棱苷酸同源挂在87—90 鬈，氨基酸同源性在90—95茗；系统进化树分析表明，分离株与所有参比序列具有较近的亲缘关系，但是差 距较大。 关键词：新型；细小病毒；VPl基因；克隆；序列测定 番鸭“白点病”(又称番鸭“花肝病”)是一种1997年开始在国内流行的疫病。目前，对于本病的 病原有不同的分离鉴定结果：早期胡奇林等…分离到了呼肠孤病毒，黄瑜等8】贝0分离到了疱疹病毒；在 法国将分离出的病毒鉴定为呼肠孤病毒；2003—2004年，本课题组在番鸭“白点病”的疾病凋查、病原 该二株病毒纯化后町以单独引起典型的番鸭“白点病”临床症状和病理变化，经病毒理化特性、核酸类 型、部分基因序列测定等鉴定，确认为细小病毒9J【“。番鸭细小病毒和小鹅瘟细小病毒，为单链DNA 是主要的结构多肽【14l【”J，是VP2的裂解产物，只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现。其相对量随着 感染进程的发展『酊增加171；VP2蛋白具有免疫原性，是刺激机体产生抗体的重要的蛋白抗原”“，vPl 一步鉴定本实验室所分离到的病毒，我们在原来所扩增的部分番鸭细小病毒VPl基因的基础上，又设 的499—4646 bp，对病毒的全部功能性基因进行了扩增并测定，然后对病毒的VPl基因进行了序列以及 系统进化树分析 1材料与方法 1．1病毒、质粒和菌株 病毒从广东某番鸭场分离得到，并经非免疫番鸭胚连续传代成稳定发病株．命名为WX0401，取 基金项目：国家自然科学基金(编号。 ‘作者简介：徐昌领(1976一)，男，山东人．硕士研究生，从事畜禽痘病病原及其防控技术方面的研究 cn 通讯作者：王林川E．mail：lcwang@scau．cdu 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 393 1．2酶与试剂 ExTaq 病毒DNA抽提试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司，其他试剂均为分析纯试剂。 1．3病毒DNA的抽提 按照上海华舜生物工程有限公司试剂盒说明书进行。 1．4 WX0401VP3特异性引物的设计 根据番鸭细小病毒匈牙利株(NC_006147)全基因序列并参考小鹅瘟细小病毒匈牙利株全基因序 1．5 PCR反应 XPCRBuffer 利用所抽提的DNA模板进行PCR反应，PCR反应体系如下：105“L，MgCl2 5pL，DNA51aL,ExTaqllaL，ddH20 2．5pL，dNTP 循环；然后72E延伸10min。 1．6病毒基因的克隆和序列测定 将PCR扩增所得到的特异性产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据Takara公司的胶回收试剂 盒说明书进行回收纯化，然后克隆至pMD．18T载体。重组质粒应用菌液PCR和质粒PCR进行鉴定， 阳性者送Invitrogen生物科技公司进行测序。 1．7序列分析 析和同源性比较应用DNASTAR完成。WX0401的参比序列来自GenBank。 2结果 进行分析。 2．1基因变异 l —w一” 』ⅢⅢ粤m女半Ⅲ女驾!m№霉m!早Ⅲ!雩Ⅲ＆*粤＆掣ⅫⅢw L0 zO ’O ∞ 50 6D 0 B0 …………………c6………cc…0…tc山