酶工程-04酶的分离纯化概要.ppt

如：在以单宁为沉淀剂时，先将酶液调到一定的pH（一般控制在4－7，不同的酶所需的pH不同），然后加入一定量的单宁（通常为酶液的0.1－1％），即可形成酶与单宁的复合物沉淀。然后分离沉淀，沉淀复合物中的单宁可用丙酮或乙醇抽提而除去；也可用pH8－11的碳酸钠或硼酸钠等碱性溶液处理，使酶溶解出来，而单宁仍为沉淀；沉淀复合物也可用Tween60（聚氧乙烯山梨醇硬脂酸酯），Tween80（聚氧乙烯山梨醇油酸酯），分子量大于6000的PEG（聚乙而醇）或PVP（聚乙烯氮戊环酮）等进行复分解反应，这些大分子与单宁形成难溶的树脂状沉淀，而使酶游离出来，单宁复合物沉淀法适用于各种来源的蛋白酶，α－淀粉酶，果胶酶，纤维素酶等的大规模生产。 以聚丙烯酸为沉淀剂时，将酶的pH调到3－5，然后加入适量的聚丙烯酸，反应生成复合物沉淀，分离出沉淀后把pH调到6以上，则复合物中的酶与聚丙烯酸分开，此时加入钙、镁、铝等离子，使之生成聚丙烯酸盐沉淀，而酶游离出来，聚丙烯酸的用量一般为蛋白量的30－40％，聚丙烯酸盐沉淀可用2N硫酸处理，这样可回收聚丙烯酸循环使用. 第六节按分子电荷的正负多少设计的分离方法 按分子所带电荷的差异建立的分离方法有吸附交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等，电荷差异主要表现在荷电多少，荷电性质。 一吸附交换分离法 吸附色普法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。 这是最早期的一种色普分离技术，1903年俄国植物学家研究植物色素的提取物，用石油醚冲洗菊根粉柱，得到分离的黄色、绿色区带，所以叫做色普分离法。1931年又有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素 的2种同分异构体，显示这一方法具有很高的分辨率。 吸附色普法操作简单，不需特殊的装置，分离物质的量小到毫克，大到上百克，主要用于某些分子量不大的物质的分离纯化，个别的（如羟基磷灰石）也适用于大分子的分离提纯，应用范围较广。 此法虽较古老，但目前仍有其实用意义 吸附过程的本质是：吸附是表面的一个重要特征之一，任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在其表面上的密集现象称为吸附。在固体－气体之间，固体－液体之间，吸附液体以气体之间的表面上，都可以发生吸附现象。 凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂，聚集于吸附剂表面的物质叫吸附物，吸附是发生在表面上的表面现象，所以需要了解固体的表面特征。 为什么分子能在固体表面停留一定的时间？这是因为固体表面上的分子（离子或原子）和固体内部分子所受的吸引力不相等，在分子内部，分子之间相互作用力是对称的，其力场相互抵消。而处于固体表面的分子所受到的力是不对称的，向内的的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层受到的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中碰到固体表面时，受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。 在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用，即有物理作用的性质，又有化学作用的特征，物理作用又叫范德华吸附，是分子间相互作用的范德华力引起的，其特点是无选择性，吸附速度快，吸附过程是可逆的伴随放出的能量较小，吸附不牢，吸附的分子是单层或多层的， 化学吸附主要是由化学键的作用引起的，如电子的转移、分子与表面共用电子对等。其特点是有选择性，吸附速度慢，不易解吸，放能大，一般吸附的分子是单层的。物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条件下可以相互转化。 由于吸附过程是可逆的，因此被吸附物在一定条件下可以解吸出来，在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。 根据吸附机制不同吸附交换分离法大体上可以分为三种 物理吸附法 羟基磷灰石吸附法 离子交换吸附法 （一）物理吸附法 在吸附的本质中已述及。常用的吸附剂有 硅胶、氧化铝、活性炭、磷酸钙、淀粉等，不同的吸附剂处理活化方法稍有差异，如硅胶的吸附能力主要和其含水量有关，含水量小于1％时，吸附活性最高，大于20％时吸附活性最低，加热使其失水的过程称为活化。 （二）羟基磷灰石吸附法 羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙，CaHPO4.2H2O,在pH7以上会慢慢变为羟基磷灰石,Ca5(PO4)3OH,在无机吸附剂中，磷酸钙是唯一的适用于生物活性大分子物质（蛋白质、核酸）的分离的吸附剂，其吸附原理是吸附剂表面的钙离子与蛋白质带负电荷的基团以及吸附剂表面的磷酸根离子与蛋白质带正电荷的基团之间相互作用的结果。 （三）离子交换层析法 离子交换作用是指，一个溶液中的某一种离子，与一个固体中 的另一个具有相同电荷的离子相互调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来，这样，溶液称为流动相，固体称为固定相。 很早人们就知道了这种离子交换现象，如用砂砾来净水，但真正了