重组腺相关病毒rAAV在神经科学中的应用讲义.pptx

重组腺相关病毒rAAV 中科院神经所病毒平台 2017年1月 腺相关病毒（rAAV）简介 腺相关病毒、细小病毒科 无包膜单链DNA病毒，基因组长约4.7-6 kb 是迄今发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，通常需要在辅助病毒的辅助下才能发生产毒性感染，生成子代AAV AAV的基因组及其编码的蛋白 AAV病毒颗粒示意图；B：AAV病毒基因组结构（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.） 病毒载体选择指南 Adenovirus Adeno-associated Virus (AAV) Lentivirus 基因组 dsDNA ssDNA ssRNA (+) 包膜 无 无 有 基因组大小 38-39 kb 5 kb 9 kb 细胞感染 分裂细胞和非分裂细胞 分裂细胞和非分裂细胞 分裂细胞和非分裂细胞 整合机制 非整合 定向整合 整合 持续时间 10天 3个月 2个月 包装能力 7.5 kb 4.5 kb 6 kb 免疫原性 强 弱 一般 滴度 10^11-12 vg/mL 10^12-13 vg/mL 10^8-9 vg/mL 转导效率 100% 70% 70% AAV载体的优势与局限 优势 安全性高 无致病性、不整合、低免疫原性 表达时程长 ＞5个月高效稳定表达 嗜性广 分裂及非分裂细胞（神经元）、多种血清型实现不同靶向 局限 外源基因容载能力有限 ＜4.7 Kb 通用启动子高表达外源基因的毒性 rAAV三质粒制备系统 A：rAAV载体原理（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.）； B：制备rAAV的三质粒系统示意图（Ayuso E et al. Curr Gene Ther. 2010.） 传统三质粒制备AAV系统的缺陷 生产能力低 103-104vg/cel 难满足灵长类研究及临床需求 病毒质量不稳定 多批次包装条件不均一 纯化过程导致的空壳率不可控 新型rAAV杆状病毒制备系统 杆状病毒系统制备rAAV的流程图 新型AAV杆状病毒制备体系的优势 灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高，适于大规模放大生产，rAAV纯化后能够达到很高的纯度，可有效解决非人灵长类动物神经环路标记的大量需求。 纯化后的rAAV病毒经过扫描电镜检测，完整的rAAV颗粒比例大于85%， 病毒质量高。 纯化后的rAAV处理后进行SDS凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测，可以观察到明显的病毒粒子衣壳蛋白VP1，VP2，VP3所对应的1:1:10 比例组成的三种蛋白，分子量与预期一致，纯度高于95%。 AAV的血清型与其对细胞组织的转导特性 不同血清型AAV对小鼠组织细胞的嗜性差异很大（Karen Kozarsky et al. Nat Methods. 2010.） rAAV的应用-视网膜内界膜细胞的感染 在内界膜注射 rAAV2-CBA-GFP，病毒感染效果图。A：在注射部位，大部分的视网膜神经细胞病毒表达水平都很高 ；B: 视网膜muller细胞和双极细胞均检测到信号（Boye SE et al. Hum Gene Ther. 2016） rAAV在肝脏纤维化研究中的应用 rAAVX-EYFP感染肌成纤维细胞效果图（Rezvani M et al. Cell Stem Cell. 2016.） rAAV的应用-脑中枢神经元的感染 rAAV-GFP注射海马感染效果图（Broekman ML et al. Neuroscience. 2006.） rAAV的应用-神经元投射研究 rAAV注射红核区，分别在7 d和30 d观察转导效率和感染RN细胞的特异性（Blits B et al. J Neurosci Methods. 2010.） rAAV的应用-心脏心肌细胞的感染 不同血清型不同滴度的rAAV病毒感染心肌细胞（Prasad KM et al. Gene Therapy. 2011.） rAAV的应用-骨骼肌细胞感染 AAV-lacZ注射肌细胞，原位杂交检测病毒的表达量（Kessler PD et al. PNAS. 1996.） rAAV的应用-肺部细胞的感染 在CMV和RSV启动子调控下AP在肺部的表达情况（Halbert CL et al. Hum Gene Ther. 2007.） rAAV的应用-神经示踪 图a.利用狂犬病毒系统逆向追踪小鼠背外侧被盖区（LDT）中PV阳性和SOM阳性中间神经元的直接调控网络示意图；图b. LDT中PV阳性和SOM阳性中间神经元都接受来自外侧僵核（LHb）的直接调控(Yang H et al. Nat Neurosci. 2016.） rAAV的应用-神经示踪 利用AAV和狂犬病毒RV