分子生物学实验课件...docVIP

实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli） DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配蛋白胨(typtone)　　　　　　　　　1.0% 酵母提取物(Yeast extraction)　　 0.5% （0.5g/100 ml）氯化钠　　　　　　　　　　　　 1.0%　121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 接种环蘸取菌液，密密划线。 倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 一天后观察菌落。 四、思考题 在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌种的什么信息？ 在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ 在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什么不是正放呢？ 你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二 碱裂解法小量提取质粒DNA 一 实验目的 了解少量方法与原理NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 三 实验材料 转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5α系列菌株微量取液器(0μl,1000μl)， 台式高速离心机溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。溶液：0.2 mol/L NaOH 1％ SDS (临用前用mol/L NaOH和2％ SDS母液稀释)。溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L饱和酚氯仿TE缓冲液1. 用移液枪取1.5ml培养液入1.5ml eppendorf管中2. 弃上清,将管倒置于纸上使液体流尽　　菌体沉淀重悬浮于00μl溶液中4. 按试剂配方配制溶液加入新配制的溶液200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次以混匀(千万不要振荡)； 5. 立即加入μl预冷的溶液盖紧管口并温和颠倒离心管，混匀冰浴中10分钟12000 rpm离心10分钟加入等体积的酚/氯仿(1:1)混匀 12000 rpm 10分钟移入干净eppendorf管中加入2倍体积的无水乙醇振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟12000 rpm离心10分钟弃上清, 将管倒置于纸上使所有液体流出加入μl预冷的70％乙醇洗沉淀将管倒置于纸上使液体流尽室温干燥 　　、将沉淀溶于μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20冰箱中。[注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好用酚/氯仿氯仿抽提。3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用但常把盐沉淀下来所以多数还是用乙醇。DNA 一、实验