动物病毒学分解.doc

《动物病毒学》实验课 讲稿 任课教师：方六荣 授课对象：2002级动物医学专业1-4班 授课时间：2004.09-2005.01  目 录 实验一 鸡胚接种…………………………………………………………1 实验二 传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养………………………6 实验三 原代细胞培养……………………………………………………9 实验四 病毒TCID50的测定………………………………………………11 实验五 中和试验…………………………………………………………13 实验一 鸡胚接种 一、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。 二、鸡胚接种的作用 主要用于： 分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒 培养病毒，制造抗原和疫苗 测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验） 测定病毒毒力 三、材料 1、鸡胚 10日龄 2、病毒 鸡传染性支气管炎病毒（IBV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球 四、鸡胚用于病毒培养的优缺点 （一）优点 1、组织分化程度低 2、可选择不同的日龄和接种途径 3、病毒易于增殖 4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒 5、容易采集和处理 6、来源充足 7、设备和操作简便易行 （二）缺点 1、胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒2、母源抗体 3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针 五、鸡胚的结构与功能 1、卵壳 上有细孔，进行气体交换 2、壳膜 使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。 3、气室 呼吸和调节压力 4、绒毛尿囊膜 起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 5、尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。 6、羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 7、卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 8、卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。 六、受精卵的选择 1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。 2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。 3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 七、鸡胚的孵育 1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 2、相对湿度：50%-60% 3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后 4、从孵育后第3天开始，每天翻卵一次 八、检卵 自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。 孵育4-5日后即可于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。 未受精卵：只见模糊的卵黄卵影，不见血管和鸡胚痕迹 活 胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胎动不明显，甚至无胎动。 死 胚：血管昏暗模糊，没有胚动 九、接种前处理 1、用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。 2、对鸡胚进行消毒。 十、接种途径 1、绒毛尿囊膜接种 2、尿囊腔接种 3、卵黄囊接种 4、静脉接种 蓝舌病毒 5、羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒 6、脑内接种 狂犬病毒 7、眼球接种 （一）卵黄囊接种法 主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。 方法一： 1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上(大头向上) 2）用碘酊和酒精消毒气室端 3）用钢锥在气室中央锥一小孔 4）用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。 方法二： 1）2）同一 3）将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的1/2处用碘酊和酒精消毒。 4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm，注入病毒液0.1-0.5ml 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，24h内死亡者废弃 （二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 方法一： 1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒 2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口 3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物 5）用胶布或透明胶纸封闭切口 方法二：（要做人工气室） 1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。 2、用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 3、在气室