基因工程常规技术-核酸提取纯化分解.ppt

解决办法： 外源RNase—高温，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液，（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套 内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等 * DEPC有刺激性，对眼睛气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。 高温高压121℃， 15min， DEPC即降解成二氧化碳和水 * 总RNA的提取与纯化 一般流程： 1、样本前处理 2、细胞裂解释放RNA 3、RNA的纯化及获得 4、RNA质量检测 * 样品前处理 新鲜血液，不超过4小时 新鲜的幼嫩组织 生长旺盛期的细胞 生长旺盛的新鲜组织 * 细胞裂解释放RNA 异硫氰酸胍/酚－TRIzol总RNA提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂 * RNA的纯化及获得 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 排除DNA分子的污染， RNase-Free 的 DNase I 消化 RNA纯化要求 * mRNA的分离 亲和层析法： 低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA； 多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（20A） RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 无poly(A) mRNA的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基+mRNP 离心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚（dT）纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀（ 无poly(A) mRNA） * RNA质量检测 紫外定量和检测 用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。 变性胶电泳质检 RNA分子的二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行。 常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 * * 蛋白质体外翻译 * * contour length：伸直长度 * * 一些RNA分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过程中被除去，但是绝大多数的RNA都和DNA一起保留在水溶液中。 最有效的除去RNA的方法： 使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子，把它们变成单核苷酸 * 常用：无水乙醇、异丙醇 乙醇沉淀法的额外优点是将短链和单体核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶处理产生的核苷酸因此在这一步得到了去除。 （3）沉淀DNA * * * 一般过程及原理： 动物组织剪成小块，匀浆或置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。 （1）组织粉碎 2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 * 0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。 （2）细胞裂解 （3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。 SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。 （5）除去RNA污染 RNase。 无水乙醇（可以加入1/10体积的3M乙酸铵辅助沉淀） 异丙醇 （4）沉淀DNA * 一般过程及原理： （1）组织粉碎 用液氮冷冻后研磨成细粉末。 3. 从植物组织中制备 DNA （2）细胞裂解 用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 65oC温育1h左右。 2% CTAB抽提缓冲液：CTAB 10 g；5 M NaCl 140 ml；0.5 M EDTA 25 ml；1 M Tris-Cl（pH 8.0） 50 ml；加ddH2O定容至500 ml。 * 用0.6倍体积的异丙醇 （3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。 （4）沉淀DNA （5）除去RNA污染 用RNase A。 （可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。 * 三、噬菌体DNA的提取 噬菌体DNA一般都是从噬菌体颗粒中制得，不从被侵染细胞中制得，因此不存在被细菌DNA污染的问题。 但除去噬菌体衣壳过程中需要用到专门技术。 一个例外：M13噬菌体的双链复制模式，像细菌质粒一样，M13噬菌体