猪鼻支原体表面可变脂蛋白vlpA黏附宿主细胞功能鉴定课程.doc

猪鼻支原体表面可变脂蛋白vlpA黏附宿主细胞功能鉴定 必雄1，倪博1，韦艳娜 （1 江苏省农业科学院兽医研究所( 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室( 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014；2山西农业大学，太谷，山西 030800） 摘要：【目的】猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症，感染率极高，且与人类肿瘤的发生有关，对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表面可变脂蛋白（vlp）家族参与了黏附宿主细胞过程，本主要vlp家族之一vlpA黏附宿主细胞功能，区。【方法】根据GenBank中已公布的vlpA的基因序列，，利用PCR扩增vlpA基因，或者人工合成区重复重复次数不等的一系列vlpA，均克隆于pET-32a(+)进行表达，获得目的蛋白。利用固相合成法制备vlpA区重复。用间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验鉴定重组vlpA蛋白肽段的黏附功能。【结果】通过诱导表达和镍柱亲和层析纯化，成功获得纯度较高的各个目的蛋白。间接免疫荧光试验证实了vlpA参与介导猪鼻支原体黏附宿主细胞；微孔板黏附试验定量检测不含区和含有重复次数为3、6、9、12次区vlpA重组蛋白，以及区的能力，结果表明区含有明显的黏附表位，区；vlpA黏附能力与其区重复次数有关，且随着重复次数增多，黏附能力下降。本研究结果研究猪鼻支原体致病机制。 关键词：猪鼻支原体；可变脂蛋白A；细胞黏附 猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis,M. hyorhinis）可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症[1-4]，通常由母猪或大猪经呼吸道传染给小猪，进而从呼吸道侵染全身引发疾病的发生。猪鼻支原体也是实验室细胞培养物的常见污染物[5]，同时近年来研究者在人胃癌组织中检测到M. hyorhinis，并进而发 现M. hyorhinis的感染与包括胃癌、大肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等在内的多种癌症有明显相关性，提示M. hyorhinis与肿瘤的发生有关，对人类健康构成威胁[6-9]。目前研究者大多认为支原体一般不通过直接的毒力因子致病，而是通过长期持续性感染引发机体慢性炎症应答而导致病变的发生。几乎所有的人及动物支原体都通过最初的黏附宿主细胞从而实现后续的体内增殖和感染，因此黏附因子在支原体感染致病的过程中起着极为重要的作用。到目前为止M. hyorhinis的黏附因子尚不清楚，这严重阻碍了其致病机制的深入研究。 为了实现在宿主中的长期存在，支原体必须有效地逃避宿主的免疫系统，在支原体的基因组常含有可变基因家族，用于编码大容量可变抗原库从而使得菌体表面的抗原性发生变化[10,11]。M. hyorhinis中发现的可变蛋白被称为可变脂蛋白（variable lipoprotein，vlp）家族[12-14]。目前共发现有7个成员，即vlpA、vlpB、vlpC、vlpD、vlpE、vlpF、vlpG。M. hyorhinis可同时表达一种或多种vlp，同时每个vlp成员内部含有数目可变重复区，其可通过插入或缺失基因片段改变重复次数，从而使整个分子的长度发生变化。通过这两种表达变异，帮助支原体改变表面抗原性，逃避宿主免疫系统。 前期研究已经发现了lp具有黏附功能，本主要针对vlp 7个成员之一vlpA的黏附功能进行具体研究，包括黏附能力检测、黏附功能区域鉴定、数目可变重复区的片段重复次数对vlpA黏附能力的影响研究。 1材料方法 1.1主要实验材料 1.1.1材料与试剂 质粒pET-32a(+)由江苏省农业科学院兽医所保存；BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。PCR各种试剂、T4 DNA连接酶、DNA和蛋白质分子量标准、Xho I和Hind 均购自TaKaRa公司；引物由南京金斯瑞生物科技公司合成；HRP-羊抗兔IgG、FITC-羊抗兔IgG购自武汉博士德公司；兔抗硫氧还蛋白多抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.1.2 PK-15细胞培养 PK-15细胞用含10%小牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL的DMEM培养液培养，待细胞汇合至90%以上时，胰蛋白酶消化。细胞以2×105个/孔接种于96孔细胞板，于37、5%CO2培养箱中培养24h。 1.2 vlpA基因的扩增及重组vlpA蛋白构建 lpA基因结构见如图1所示，其中区编码信号肽，区为可变数目重复区。根据GenBank中已公布的猪鼻支原体 vlpA基因序列，利用Oligo7软件设计引物，从猪鼻支原体基因组中扩增vlpA基因（不含信号肽）。PCR引物序列为：