现代生物技术制药工艺学剖析.ppt

连接酶 ku 活性形式 还原剂 辅酶 平末端 突出端 DNA RNA ss DNA RNA与RNA 切口补平℃ T4 DNA连接酶 62 单体 ＋ ATP，Mg ＋， 15～25℃ ＋ 4℃ ＋ — － 37 大肠杆菌DNA连接酶 77 聚体 － NAD+ Mg － ＋ 10～15℃ － － － 37 热稳定性连接酶 ? ? ＋ NAD+ Mg － ＋ 24～37℃ － － － 65～72 T4 RNA连接酶 47 单体 ＋ ATP， Mg － － － ＋ ＋ ? 连接酶的各种特性 四、DNA聚合反应与聚合酶 DNA聚合酶：催化DNA分子进行体外合成反应，与体内相似，一般需要模板，合成产物为模板的互补序列。根据聚合酶依赖的模板，可分为： 依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段、T4和T7 DNA聚合酶及热稳定性DNA聚合酶； 依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶。 不依赖于模板的聚合酶：能把核苷酸加到DNA分子的末端，即末端转移酶。 依赖于DNA的RNA聚合酶： 热稳定性DNA聚合酶和反转录酶已在相关节介绍。 酶 ku pH 温度℃ 延伸速度 加工性能 模板 聚合酶活性 外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 109 7.4 16～22 20～30 10～50 ssDNA ssRNA 5′→3′ ? 5′→3′ 3′→5′ Klenow片段 68 7.4 16～22 20～30 10～50 ssDNA ssRNA 5′→3′ 3′→5′ T4DNA聚合酶 114 8.8 37 ? 100 ssDNA 5′→3′ 3′→5′ Taq DNA聚合酶 94 8.3 75～80 ? ? ssDNA 5′→3′ 无 末端转移酶 60 7.2 37 ? ? ssDNA dsDNA 5′→3′ 无 多核苷酸聚合酶 58 8.0 37 ? ? ssRNA 5′→3′ 无 T7 RNA聚合酶 98 8.0 37 ? ? dsDNA 5′→3′ 无 SP6 RNA聚合酶 96 7.5 40 ? ? dsDNA 5′→3′ 无 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′→ 3′ 外切活性 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′→ 5′ 外切活性 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5 5 5′→ 3′ 聚合活性 5′→ 3′ 聚合活性 3′→ 5′ 外切活性 5′→ 3′ 外切活性 大肠杆菌DNA 聚合酶I和Klenow 酶 Klenow 酶是大肠杆菌DNA 聚合酶I的大片段。 大肠杆菌DNA聚合酶I活性： 5’→3’的DNA 聚合活性；（ Klenow 酶） 3’→5’的核酸酶外切活性；（ Klenow 酶） 5’→3’的核酸酶外切活性，核酸内切酶活性。 Klenow 酶用途： 1）3’凹端补平，使之成为平末端； 2）对DNA片段进行标记，合成探针； 3）用于催化cDNA第二链的合成； 4）用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。 T4-DNA 聚合酶 具有5’→3’的DNA聚合活性和5’→3’的核酸外切活性，而且具有极强的3’→5’核酸外切活性，后者对单链DNA的作用远大于双链DNA。用于修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3’突出末端。 末端转移酶来源于小牛胸腺，可以进行非模板依赖性合成DNA，其合适的底物形式为带有3′ 游离羟基的双链DNA分子。当底物为3′ 端突出的双链DNA时，在Mg2+的存在下，可将脱氧核苷酸聚合在两条链的3′ 端。对于平头或3′ 凹端DNA底物，则需要Co2+激活，但聚合反应仍不按模板