1.无菌操作与细胞复苏素材.ppt

其他培养用液 １、消化液 　（1）胰酶(trypsin)溶液： 浓度一般为0.1％～0.25％ 配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液 　 　 （2）EDTA溶液： 使用浓度为0.02%；可与胰酶的混合使用 　 　　 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存 （3）胶原酶(collagenase)溶液： 使用浓度为0.1～0.3mg／L或200000U／L， 作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、 Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。 胶原酶作用温和，不易对细胞产生损伤。 在上皮类细胞原代培养时经常使用 缺点：价格昂贵 ２、谷氨酰胺补充液 　　合成培养基中必需成分，但容易降解，所以 都是在使用前添加。 　　谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配 制为100倍浓缩液，配制时应加温至30℃，完全 溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20℃。 3、pH调整液 　 常用的有 HEPES液 　　　　　 NaHC03 NaHCO3 溶液（常用） 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存 HEPES（分子量238.31）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 防止培养基pH迅速变动。 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L 　４、抗生素液 青、链霉素的配制及使用浓度 青霉素80万U加Hank’s液至80 mL，浓度1万u/ mL 链霉素100万U（相当于1g）加Hank’s液至100 mL，浓度10mg/mL 分装后至-20℃冰箱保存 使用浓度：青霉素－ 100u/mL 　　　　　　链霉素100ug/mL 注意： 尽管很多实验室在细胞系的培养基中常规加入抗生素作继代培养，但仍建议不要在原代培养中加入抗生素。 酚红 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用  第三章  细胞的冻存与复苏 一、培养物的冷冻保存与复苏原理 冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。 细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤 　　　　　　　　　　　　　　溶质损伤 　冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。 冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。 　 　　　　　　　　　　　 溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。 　细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。 溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重 如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。 保护机理： 冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成 ； 通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。 冷冻保护剂：可保护细胞免受冷冻损伤的物质。 分为：渗透性： 常用甘油、DMSO 　　　 非渗透性 甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。 注意：由于