1-1.工具酶素材.ppt

D 基因工程的支撑技术 A 重组DNA技术的理论基础 B 基因的分子生物学 C 基因工程的基本原理 基因工程工具酶 限制性内切酶 凡是能识别和切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，称为限制性核酸内切酶（restriction endonucleases，RE）。简称限制性内切酶或限制酶。 一、限制性内切酶的命名 限制性内切酶命名的次序如下： 用3个字母代表来源的生物 （如Bam 代表 Bacillus amyloliquefaciens） 1个字母或阿拉伯数字代表菌株（Bam H） 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序（Bam HI） 二、限制性内切酶的分类 亚基组成 酶切位置 识别位点 辅助因子等 四 、一些概念 粘末端和平末端 同尾酶 同裂酶 同识异切酶 消化 星号活力 七、限制性内切酶的反应条件 影响限制性核酸内切酶活性的因素1. DNA的纯度和物理特性 DNA的纯度 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。 思考 基因工程技术的发展给人类带来的影响？ 基因工程技术在应用中存在的主要问题？ 基因工程技术的发展方向？ 作业 基因工程的基本过程？ 获取目的基因的方法？ DNA片段如何与载体连接? 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记 5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P HO-G-C-T-C … 5’ Klenow dTTP α-32P-pppdA 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P HO-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ DNA聚合酶 DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA酶的基本特性： 5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’ 的核酸外切酶活性 在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 5’ … G-C-T-C-OH P-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-P HO-C-C-T-C … 5’ T4-DNA聚合酶 DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记 T4-DNA聚合酶 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G-G-T-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C- T-C- C-A-C … 5’ 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-OH HO-C-G-T-C-C- T-C- C-A-C … 5’ Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（α-32P-dATP） T4-DNA聚合酶 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G-G-T-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C- T-C- C-A-C … 5’ DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链 3’ AAAAAAAAAAAAAA