蛋白质分析方法进展与应用讲义.ppt

蛋白质分析方法进展与应用  第十一组 内容 前言 分析法概述 电泳技术 质谱技术及应用 前言 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 分析法概述 浊度法和凯氏定氮法 吸光光度法 紫外光谱吸收法 双缩脲法 劳里法 4-喹啉甲酸法（BCA） 染料探针法 染料-金属配合物探针法 共振瑞利散射法 分析法概述 荧光光度法 内源荧光法 外源荧光法 有机荧光探针 稀土荧光探针 荧光偏振 时间分辨荧光光谱法 激光诱导时间分辨免疫分析法 高效液相色谱法 电泳法 电泳技术 等电聚焦电泳 固相pH梯度等电聚焦（ IPGIEF） 凝胶电泳 SDS尿素聚丙烯酰胺 用于低离子强度 下不溶的膜蛋白 非变性凝胶电泳 可区分仅有一个电荷单 位差别的分子，降低蛋 白质变性机率，可直接测酶活 不连续盘状电泳 不连续盘状电泳 包含两种以上的缓冲溶液、pH和凝胶孔径，多用于分析浓度较稀的样品，可使蛋白质浓缩数百倍。 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 质谱技术 　　　质谱（ M S）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比的大小顺序排列的图谱。 　　　以往质谱仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 蛋白质的质谱分析方式 蛋白质图谱（protein mapping）：即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，有哪些信誉好的足球投注网站与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。 利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。 用化学探针或酶解使蛋白或肽从Ｎ端或Ｃ端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，即梯状测序（ladder sequencing），经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。 　　　质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：灵敏度高，需试样量少，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。目前软电离技术的发展与完善使极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da 快原子轰击质谱测量法（FABMS） 快原子轰击是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究，能提供有关离子的精确质量。FABMS-MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息， 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法（MALDI-TOF MS） 　　　 待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质（matrix）混合挥发，用激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪。将探测器录得的多肽m/z同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的m/z进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白。此法称为多肽质量指纹分析。 优点：敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，现有数据库中有充足的关于多肽m/z的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。 电子喷雾电离质谱测量法（ ESI-MS） 　　　由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样品由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。杂质成分挥发后，碎裂的多肽离子进入连续质量分析仪，选取某一特定m/z的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后分析电离片段并汇集成离子谱（ion spectrum），通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。 表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术（SE