蚊类的鉴定分类讲义.ppt

序列测定和序列分析 取LB培养基3ml，同时加入氨苄青霉素，用接种环挑取鉴定阳性的菌落在LB 培养液中混匀，于37℃ 过夜培养，分装入1.5ml Eppendorf离心管中，进行序列测序。用DNAStar软件进行序列比对及同源性分析。（序列测定可由公司完成） 蚊虫携带日本脑炎病毒的检测 * * * 第八节 蚊媒病病原体的检测 蚊媒病病原体的检测 1.疟原虫的检测 2.丝虫幼虫的检测 3.常见蚊媒病毒的检测 疟原虫的检测 中间宿主(人)体内疟原虫的检测 厚血膜染色法：取患者（人或其它动物）外周血2-3mm3，滴于载玻片上；涂成直径为1厘米的圆形血膜，充分干透；加蒸馏水溶血，充分晾干；甲醇固定；染色（瑞氏或吉氏染色）；镜检。 薄血膜染色法：取患者（人或其它动物）外周血1mm3，滴于载玻片上；推成薄血膜，充分干透；甲醇固定；染色（瑞氏或吉氏染色）；镜检。 注意事项: a.取血时间应在病人疟疾发作时(恶性疟)或发作后10小时以内(间日疟、三日疟)。 b.恶性疟初发时只能查到环状体，而配子体在外周血中出现的时间则在查到环状体之后的10天左右。 c.厚血膜的厚度要适中，过厚则易脱落。 d.刺激法取血：患者可先用1%的肾上腺素或1%的麻黄素皮下注射刺激（0.5-1.0毫升），促使较多的疟原虫在外周血中出现。注射后15、30、60分钟取血涂片检查。 e.注意区分四种疟原虫不同的形态特征。 归国劳务人员中检测到疟原虫 终宿主(蚊)体内疟原虫的检测 1 动合子的检测 2 胃卵囊的检测 3 成孢子细胞的检测 4 子孢子的检测 动合子的检测 动合子的检测（蚊虫吸血后的4—48小时）：解剖雌性媒介蚊虫，取蚊胃；挤出蚊胃血，推成薄血膜（若血液过于浓缩，加适量0.65%的昆虫生理盐水稀释）；甲醇固定；染色（瑞氏或吉氏染色）；镜检。 胃卵囊的检测（蚊虫吸血后1-7日为早期卵囊；8-14日为后期卵囊）：解剖雌性媒介蚊虫，取蚊胃；用解剖针将蚊胃从正中依纵行方向剖开，铺成薄片；晾干；甲醇固定；染色（瑞氏或吉氏染色）；镜检。 胃卵囊的检测 成孢子细胞的检测：（蚊虫吸血后8-10日）：解剖雌性媒介蚊虫，取蚊胃；用解剖针将蚊胃壁上的卵囊剥离下来，使之彻底破裂，将内容物散出；晾干；甲醇固定；染色（瑞氏或吉氏染色）；镜检。 子孢子的检测：（蚊虫吸血后12-15日）：解剖雌性媒介蚊虫，取唾液腺；在载玻片上加微量昆虫生理盐水，将唾液腺置于水滴中，待子孢子逸出时，稍晾干；火焰固定；染色（瑞氏或吉氏染色）；镜检。 常见蚊媒病毒的检测 蚊媒病毒的检测必须经过专业培训，在具有一定生物安全等级的实验室内进行。条件不成熟时切勿仓促进行！ a.试验前应进行充分的准备，参与试验的人员要经过严格的培训，建立完善的试验方案。 b.试验过程中加强个人防护：正确使用防护器材，包括一次性手套、隔离服、眼罩等。 c.有完善的防蚊虫和其它试验动物逃逸的措施。 d.建立意外事故(感染蚊虫的叮咬、动物抓伤或咬伤、手套破裂、手外伤等)处理方案。 e.试验结束后对所有接触或可能接触到病原体的物品（试验桌面、手套、研钵、离心管、吸管、蚊笼、鼠笼等）及动物尸体进行彻底的消毒，杜绝随意丢弃。 蚊媒病毒的检测鉴定 1.病毒分离 2.血清学诊断：间接免疫荧光抗体试验（IFA） 3.基因诊断:RT-PCR检测蚊媒病毒基因 病毒分离 1 蚊虫标本的采集和处理 采集的蚊虫冷冻麻醉，分类后10-50只为一组，放入研钵内用无菌生理盐水洗数次，研磨成匀浆；用含1%小牛血清的病毒稀释液稀释成10%的悬液；按青霉素1000U/ml，链霉素1000μg/ml加入到标本中；离心后取上清液接种。 若暂时不能开展实验，可将采集的蚊虫置于液氮中冻存备用。 2.细胞接种分离病毒 将上清液接种到C6/36细胞，观察7天。若有病毒感染，细胞会出现病变，表现为细胞皱缩，颗粒增多，融合成片，最后破碎死亡。若无明显病变可盲传三代。接种后24小时出现类似细胞病变的现象为标本对细胞的毒性反应，应视为非特异性变化。 细胞培养过程中执行严格的无菌操作。 除C6/36细胞（白纹伊蚊细胞）外，其它常用的细胞有：Vero（非洲绿猴肾细胞系）,BHK-21（乳金黄色地鼠肾细胞系）。 出现典型病变的C6/36细胞 正常C6/36细胞（对照） 3.动物接种分离病毒 1~3日龄健康乳鼠，脑内接种上清液，在有防护设备的动物房中饲养。逐日观察5-7天，若发病则出现典型神经症状，表现为拒乳、抽搐、麻痹等。当乳鼠频死时将其处死，解剖，取鼠脑。研磨、离心后取上清再进行传代，可盲传三代。等发病规律稳定时收集毒种保存并鉴定。（48小时内