2013秋季酶工程实验记录.doc

班级 姓名 学号 班级 姓名 学号 果胶酶的固定化及其活力测定 一、目的： 果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。在果品加工业中，果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减少外源物质对果制品的污染。果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大提高了产品生产成本。固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本。 通过本实验，了解载体的制备方法，掌握酶的固定化原理及方法。 二、原理： 本实验固定化方法为共价结合法。以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。壳聚糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（α-氨基-1.4-β-葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用，是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。戊二醛交联是双功能团醛基与壳聚糖和酶分子中的氨基发生亲核加成反应生成西佛碱(Schiff base)，通过共价键结合。其键合机理如下： 壳聚糖的氨基+OHC(CH2)3CHO+酶的氨基→壳聚糖－N=CH(CH2)3CH=N－酶 果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。 三、试剂及仪器 仪器：冷冻离心机 分光光光度计 比色皿（8只） 摇床 水浴箱 混合振荡器 天平 瓷盘 药匙 剪刀(1把) 记号笔（1支） 通风橱 吸水纸 具塞刻度试管（6支） 三角瓶（2支） 烧杯（50ml×2只，100ml×1只） 试管架（1个）试管（8支） 量筒（100ml×1只） 离心管(5ml×2个,50ml×1个) 移液管架(1个) 移液管(1ml×1支，2ml×2支,5ml×1支) 注射器（5ml ×1支） 滴管(1个) 吸耳球（1个） 洗瓶（1个） 玻棒（1个） 烧杯(300 ml×5只) 试剂：乙酸－乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH5.0） 氢氧化钠溶液（1.6mol/L） 磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5－二硝基水杨酸 氢氧化钠 冰醋酸 丙三醇 戊二醛 无水乙醇 浓盐酸 果胶酶 果胶 半乳糖醛酸 壳聚糖 蒸馏水若干桶 四、方法步骤 1 载体的制备---实验第一天上午做完 1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。 1.2每组配制60ml 10%(100mL水中10g)的NaOH溶液,均分到三个小烧杯中。待放凉至室温后用注射器吸取约3ml壳聚糖的溶液滴入10%的NaOH溶液中，即得到壳聚糖的微珠。每组共做三份相同量的微珠，静置10min，蒸馏水浸洗至中性，最后将三份载体合并，用20pH7.0的磷酸缓冲液浸洗一次（3min）。 1.3倾去磷酸缓冲液，进行下面步骤。 2 载体的活化---实验第一天上午做完 各组在100ml三角瓶中配制4%的戊二醛溶液约40ml，加入用磷酸缓冲液处理过的载体，封口，室温活化5h，中间摇动。 3 偶联—-3.1步实验第一天上午做完；3.2、3.3、3.4步实验第一天下午做完 3.1取果胶酶0.3g，加入18ml水、2ml乙酸－乙酸钠缓冲液，摇床上室温低速振荡提取5h。 3.2将小三角瓶中提取过5h的粗酶液8000rpm离心10min，上清液即初始酶液，初始酶液总体积为 ，留3ml酶液置于一支干净的5ml离心管中4℃备用，其余初始酶液进行下面实验。酶液不用时置于4℃。 3.3用蒸馏水小心浸洗除去游离戊二醛（约浸洗5次）。 3.4用所剩酶液覆盖载体，4℃过夜，中间摇动几次。 4 固定化酶和游离酶的活性检测—实验第二天上午做完 4.1固定化酶和游离酶的回收与保存具体步骤：将三角瓶中过夜偶联的酶液过滤回收，再用少量水小心浸洗微珠除去游离酶（约浸洗4次），滤液全部合并回收在小三角瓶中。回收的滤液即残余酶液，残余酶液总体积为 ，置于4℃备用。收集小球，称微珠总重为 ，4℃保存备用。挑出完整的20粒固定化酶颗粒称重，要称两份。