DHPLC在微生物耐藥性检测中的应用.doc

利用高效液相色谱技术（dHPLC）对CTX-M超广谱β-内酰胺酶快速分型 Li Xu1,2, Jason Evans1,2, Thomas Ling3, Kathy Nye,1 and Peter Hawkey1,2* 通讯地址: Health Protection Agency, West Midlands Public Health Laboratory, Heart of England NHS Foundation Trust, Bordesley Green East, Birmingham, B9 5SS, U.K. 电话: 44 (0) 121 424 1240. 传真: 44 (0) 121 7726229. E-mail: peter.hawkey@heartofengland.nhs.uk 摘要 dHPLC是广泛用于遗传变异检测的强大技术。本文是第一例将dHPLC应用于细菌β-内酰胺酶基因的快速分型的应用报告。该技术适用于所有产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶 (ESBLs) 细菌 DNA 同源群体的基因分型。选用13个定义清晰的blaCTX-M 菌株用于开发和优化dHPLC分型方法。进一步的评价了盲选的62个临床样本。结果显示依赖dHPLC的blaCTX-M分型结果与DNA测序结果完全一致。应用新发展的依赖dHPLC的分型技术，我们在为期4个月的临床调研中成功分型所有的73株blaCTX-M菌株。并且，我们首次在英国报道了由E.coli 产的CTX-M-14 和 CTX-M-1 导致的严重性的临床疾病。我们将这项新的dHPLC检测技术总结为精准，快速和经济的blaCTX-M菌株分型技术，在对新的或不同的blaCTX-M基因型临床指导方面，以及流行病学和监测项目方面具有强大的潜在应用价值。 前言 从医院或社区获得性感染革兰阴性杆菌从而产生超广谱β-内酰胺酶已成为一个世界性的严重问题（4）。产CTX-M型的超广谱β-内酰胺酶 (ESBLs)，不是TEM或SHV的衍生类型，代表一种新的快速增长的ESBLs分子类型A家族（4）。根据氨基酸序列相似性，他们可以分为5个系统进化群体：群体1，2，8，9和25/26。到目前为止，已有50多个产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶被定义。()。在英国，产CTX-M-9产酸克雷伯氏菌的分离在利兹首次报道，产CTX-M-9肺炎克雷伯菌的第一次爆发在Birmingham市中心医院（7）。在2002年底，在英国偏远地区分离到的大量产ESBL大肠杆菌被认为与什罗普郡的疾病暴发有关（3）。有趣的是，分析York人群粪便样品中产CTX-M类型ESBL细菌，呈现大量不同分子亚型，包括CTX-M-9，-14和-15（34）。首例分离到CTX-M-3（群体1），CTX-M-17，-18（群体9），CTX-M-8，-40（群体8）类型的β-内酰胺酶也是最近从英国报道的（3，16，35）。 CTX-M类型ESBLs的多态性和日益增加的流行性表明英国分子流行病的复杂性增加。Whist CTX-M-15 是主导类型，但我们注意到ESBLs基因类型正在增加，例如CTX-M-14（Dr. Li Xu 未发表的观察）。 因此需要一种高通量，低成本的方法来检测CTX-M β-内酰胺酶的特定基因型。 大量分子方法，包括多重PCR已经成功的应用于五种群体所有成员的监测（36，39）。然而不借助完整的DNA测序，精确的定义CTX-M类型β-内酰胺酶基因任然存在争议。目前，测序还是精确识别的唯一办法，虽然具有耗时和昂贵的缺点。 变性高效液性色谱dHPLC是一个相对新的遗传变异检测技术，该技术的应用原理在别的论著中有详细介绍（38）。它已成功的应用于疾病相关基因的突变筛查（13，20），最近几年该技术首次用于细菌鉴别和分子分型，以及随后应用于抗生素抗性基因变异的监测，如对金黄色葡萄球菌, 沙门菌, 鼠疫耶尔森氏菌和淋病奈瑟菌的gyrA和grlA的突变筛查（10，14，17）。识别突变与抗结核药物抗性间的关联分析在基因rpoB，katG，pncA，rpsL 和 embB中都已有报道（9，32）。我们研究的主要目的是确定一个灵敏，快速和高通量的CTX-M类型 ESBLs的 基因分型技术。dHPLC分型技术由三个步骤构成：通过多重PCR分别扩增参照DNA和临床分离DNA，通过对照和待测PCR产物的混合、变性、复性形成异源双链；通过dHPLC分析异源DNA。我们首先利用产CTX-M型ESBLs的标准菌株发展了这项技术，而后利用62个过去已定义的临床样本报对该方法作了评估（39）。最后dHPLC方法被应用于探索不同CTX-M类型ESBLs在我们医院的流行性；一个为期4个月的调研从20