Menke體外产气法.doc

Menke体外产气法（Syringe系统）——管子 （一）基础知识 体外产气法主要理念 通过体外产气装置模拟瘤胃发酵 体外产气系统组成 体外产气装置：产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：由瘤胃液与人工唾液按1:2的体积比混合，搅拌均匀而成 影响实验成败的主要因素 实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键 （二）试验前准备 试配产气管 ①更换注入口处老化的塑胶管；②试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。 称量样品 ①产气管编号；②用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（DM），置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；③样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。 配制原液 正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。 其它 ①调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5℃，摇动速度5×10转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5℃（以实际量取温度为准）；②准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；③贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。 （三）正式试验 配制人工唾液 ①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；②计算人工唾液需要量：体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；③配制还原剂（E液，见附表1）；④按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。 采集与处理瘤胃液 为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；④用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。 吸取微生物培养液 用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。 记录初始微生物培养液量 排气过程：将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。 空白对照和标准对照 实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。 记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；精料一般培养到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。 产气量计算 （管子） 式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；W为样品干物质重（mg）；GP空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。 重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。 (四)样品采集 测定项目 取样时间 取样部位 取样量 重复数 处理 保存温度 VFA 实际需要 上清液 1ml - 加入0.2ml 8.2%偏磷酸，20000g离心10min 4℃ NH3-N 24或48h 混合液 5ml - -20℃