杉木木材形成过程扩展蛋白Ezpansin基因的克隆与表达分析.pdf

418 第五届博士生学术年会论文集 杉木木材形成过程扩展蛋白(Expansin)基因的克隆 与表达分析① 王桂凤 高 燕 杨立伟 施季森⑦ 林木遗传与基因工程江苏省和国家林业局重点实验室， 南京林业大学，江苏省南京市，210037 摘 要扩展蛋白(expansin)是一类细胞壁结合蛋白，在一定的PH值下无需任何激活 蛋白就可诱导细胞壁的伸展。以木材形成的特异表达文库获得的扩展蛋白EST序列为基础， 通过RI．M—RACE技术成功克隆到3条全长扩展蛋白基因。其中Ch-EXPlcDNA全长 1033bp，包括247个氨基酸的开放阅读框(ORF)区；Ch—EXP2cDNA全长1374bp，包括268 个氨基酸的开放阅读框(ORF)区；Ch-ELPlcDNA全长1023bp，包括272个氨基酸的开放阅 高；Ch-ELPl在形成层及成层及针叶中均有较高的表达，其他组织中差异不明显。该组的基因 成功克隆，将为系统研究扩展蛋白在木材形成过程中的表达情况、功能及调控机制奠定基础。 关键词 杉木木材形成 扩展蛋白 木质部分化 扩展蛋白(Expansin)被认为是植物生长过程中细胞擘伸展的关键调控因子。它是一类植物细胞壁 蛋白，在酸性条件下诱导细胞壁伸展并缓和壁的压力。扩展蛋白的发现起始于1989年Cosgrove对黄 瓜下胚轴细胞壁酸诱导伸展的研究。在随后的研究中发现扩展蛋白参与各种不同的发育过程，包括种 子萌发，分生组织动力学，果实软化，根发育，茎伸长，叶生长，花开放与凋谢，以及适应反应。尽管扩展 蛋白基因在许多植物组织和器官中表达，但是其中一些表现出器官和组织表达的特异性。 扩展蛋白由多基因家族编码。根据编码蛋白序列的相似性，可将扩展蛋白至少分为四类：ocexpansin， 整C末端。8-expansin能编码较短的蛋白质，该蛋白质与一般扩展蛋白的C末端具有高度的相似性，但 缺少一半N末端。Im等在百日草(Zinneaelegans)初生木质部形成过程中发现扩展蛋白的表达； Madoka等报道了扩展蛋白在杂交杨(Populus)次生木质部形成中的表达情况。 本研究以杉木(Cunninghamia 隆出可能与形成层分化相关的2个a-expansin基因和1个Expansin—likeprotein基因。这组的基因成 功克隆，将为系统研究扩展蛋白在木材形成过程中的表达情况、功能及调控机制奠定基础。 theNational973 ①基金项目：国家“973”项目(TGl99901600004)第四课题项日资金资助项目[Supportedby Program(No． TGl9901600004)]。 ②通讯作者：施季森，博士生导师。电话：025E—mail：jishi@njfu．edu．cn。 农业与林业 4j9 一、材料 (一)植物材料 实验以生长较快材性较好的句容0号杉木为材料，根据杉木维管形成层的分化规律，取形成层活动 旺盛时期的3年生茎段，剥皮后迅速以液氮速冻，置于一70。C备用。 (二)试剂 GeneRacerTM cDNA RACE—Ready Kit购自Invitrogen公司，pGEMT-easy 公司，切胶纯化试剂盒，DNAMarker和DNA 存，其余试剂均为分析纯。 (三)总RNA、DNA的分离 物质的干扰。杉木基因组DNA的提取方法采用Sambrook等(1989)的CTAB法提取幼嫩叶片。 (四)引物的设计与合成 如表1所示，引物委托上海赛百盛公司合成。 表l RACE基因特异性引物 (5-)cDNA的克隆与序列测定 取形成层活动旺盛的杉木茎段的总RNA2肛g。根据RACE试剂盒说明将其反转录合成cDNA，以 该eDNA为模板用5’和37基因特异性引物及试剂盒自带的RACE引物分