SimultestIMK双色.docVIP

Simultest IMK双色淋巴细胞亚群检测试剂盒 演示双色试验样本获取和分析： ㈠ 试验准备： 1、 实验目的和原理：利用荧光技术在不同的鼠抗人抗体上标记荧光素，该荧光抗体就同人外周血中淋巴细胞表面的CD分子特异性结合，然后用流式细胞仪检测，计算各淋巴细胞亚群的百分比，了解人的免疫状态，从而指导临床诊断和治疗。 2、血样采集：用EDTA真空采血管采集静脉血2ml，反复颠倒8-10次，充分混匀；血样采集后6小时内处理、检测。 3、主要试剂： a：Simultest IMK Lymphocytes Kit检测试剂盒： ①Isotype Control（MouseIgG1/IgG2a） ④CD3 FITC /CD8-PE ②CD3-FITC /CD19-PE ⑤CD3-FITC /CD16+CD56-PE ③CD3-FITC /CD4-PE b：FACS Lysing Solution溶血素（10×，使用前用蒸馏水稀释成1×）。 c：PBS溶液。 样本制备： ① 取5支流式上样管，编号为1、2、3、4、5，分别取100μl充分混匀的抗凝全血加入每支管管底，注意不要碰到管壁。 ② 依次加入20μl双标Isotype Control（MouseIgG1/IgG2a）、CD3/CD19、CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD16+CD56荧光抗体，涡旋混匀。室温避光孵育15-30分钟。 ③ 取出试管，每管加入10倍稀释的1×FACS Lysing Solution 2ml，涡旋混匀，室温避光10(2分钟。300g（约1200rpm）离心5min，弃去上清液。 ④ 每管加入2ml的PBS，涡旋混匀，300g离心5min，弃去上清液。 ⑤ 每管加入0.5ml PBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml 1-2%的多聚甲醛，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。 5、注意事项： ① 弃掉试管中上清液时，一定保证一次性垂直倒掉，不能反复倾倒，防止细胞丢失。 ② 2~8℃保存，抗体试剂在保质期内稳定，不能冻存。抗体保存期间或与细胞孵育时注意避光。试剂瓶应保持干燥。 ③ 任何试剂的外观改变，如沉淀、变色，都表明试剂已不稳定，这时试剂不能使用。 ④ 为得到理想结果，血样应在静脉穿刺后6h内染色。 ⑤ 操作时如未按指定的孵育时间、离心次数或温度进行，容易发生错误。 ⑥ 抗体试剂虽含有叠氮钠保护剂，仍需注意微生物污染，以免导致错误结果。 6、中国人群淋巴细胞亚群正常参考值（采用此Kit检测，各实验室最好建立自己的参考值） CD3（总T淋巴细胞） 50-84% CD3+CD4+(Th细胞) 27-51% CD3+CD8+(Tc/Ts细胞) 15-44% CD3-CD16+CD56+(NK细胞) 7-40% CD3-CD19+（B细胞） 5-18% CD4/CD8（Th/Ts） 0.71-2.78 ㈡ 流式上机检测： 1、 在“浏览框”中建文件夹（2C）和实验组（LYM），样本（日期），5个采集管（Mouse IgG1/IgG2a、CD3/19、CD3/4、CD3/8、CD3/16+56），并重命名。 2、将“浏览框”的采集箭头选中采集管，点击“仪器框”的参数parameter页面，删除不必要的荧光参数，仅保留FITC和PE，散射光参数选择线性，荧光参数选择对数，所有参数均选择A面积信号。 3、在“通用工作页面”上建获取模板： 一共画2个散点图。 ① 第一个图，横轴FSC-A，纵轴SSC-A，在中下部设圈定淋巴细胞的矩形门P1； ② 第二个图，横轴FITC-A，纵轴PE-A，选中该图后： 单击右键，在“Show Population”下选中P1，即仅显示P1淋巴细胞门内的颗粒。 单击右键，选择“Show Population Hierarchy”。 单击右键，选择“Creat Statistics View”，右键单击统计图，选择“Edit Statistics View”， 选择相应荧光参数的mean。 选中这两个图，单击“信息查看框”的“Title”页面，选中“Tube”和“Population”复选框。 ③ 定义每个样本管的参数标志，参数标志将显示在数据图的坐标轴上和统计表中。 选择ExperimentExperiment Layout路径 在出现的对话框中的“Label”一栏中，输入每管正确的荧光标志。比如，在FITC区域中输入CD3；用Tab键或鼠标转换输入区域。 在“Acquisition”一栏中，输入每管要获取的微粒总数10000个。 4、手动脱机补偿及上机检测： ① 放第一管同型对照管在流式细胞仪上： ⑴ 确认绿色的数据采集箭头指向该管，点击“Load”上样，看通用工作页面的散射光点图