极端嗜盐古菌蛋白类抗生素HalC8的生物合成及抗性机制.pdf

福建霞q。 第三甚海捧高技术{幺坛 2005．08．19-23 极端嗜盐古菌蛋白类抗生素HalC8的生物合成及抗性机制+ 厉云孙超岷梅双双陆秋鹤周利刚 向华宰 中国科学院微生物研究所微生物资源国家重点实验室 北京中关村北一条13号100080 C8 是由极端嗜盐古菌HalobacteriumAS7092产生的性质极端稳定，抑茵谱广的蛋白类抗生素， 对于极端古菌遗传操作系统的构建及蛋白类新药的研究具有应用前景。本文介绍了c8合成相 关基因的克隆及抗性的分子机制，是在国际上首次发现嗜盐菌素的抗性基因，也是在三域生 命中首次发现一个基因同时编码蛋白类抗生素及其免疫蛋白。本论文还将涉及c8基因簇克隆 的进展及嗜盐古菌遗传操作系统构建的部分内容。 关键词：极端嗜盐古菌，蛋白类抗生素，基因簇，抗性机制，遗传操作系统 早在上个世纪二十年代，人们就在大肠杆菌(Escherichiacoli)中发现了它们之间的相 互抑制作用，并把产生这种抑制作用的物质称之为大肠杆菌素(colicin)。此后，又陆续在其 它细菌中发现了这种有抑制作用的物质，统称为细菌素(bacteriocin)，它们是由核糖体合成的， 对相近属或种的微生物有抑制作用的蛋白类抗生素。六十年代开始，又陆续在真核生物如青 蛙、螃蟹、昆虫、某些真菌和植物中发现了类似的蛋白或多肽类抗生素，并把这些由真核生 现了类似的对其相近属或种的嗜盐古菌有抑制作用的蛋白类抗生素，相应的称为嗜盐菌素 (halocin)[1】。与生命的三域相对应，把由古菌产生的此类蛋白类抗生素称为古菌素 此类抗生素，而且证明是极端嗜盐古菌尤其是杆菌的一个普遍的生理现象[3]。与细菌素相似， 嗜盐菌素通常由质粒编码、核糖体合成的。 基因克隆与分析是揭示嗜盐菌素生物学机制的重要基础，但此前国际上完成编码基因克隆的 质稳定，但抑菌谱很窄。本研究组分离纯化的嗜盐菌素HalC8则兼具性质稳定与抑菌谱广的 双重优点[6】。本文将介绍HalC8的主要特性，时期特异性表达特征，蛋白剪切，基因克隆，嗜 盐菌素抗性基因在国际上的首次发现，及在三域生命中首次发现一个基因同时编码蛋白类抗 生素及其免疫蛋白的新机制。论文还将介绍HalC8基因簇克隆的必威体育精装版进展。籍此，嗜盐菌素 HalC8已成为目前研究极端古菌基因表达调控、蛋白合成与加工、以及蛋白质结构与功能的重 4通讯作者。Email：xiangh@sun．im．fie．cn；Tel：8610 ’ 106 禳建爱n 幕三鑫海洋毒筏木论嚣 2005．08．19-23 要体系。 1嗜盐菌素HalC8的分离纯化及性质测定 首先通过分析极端嗜盐古菌发酵产物对其它菌株的抑菌作用，对22株来自不同种属的 极端嗜盐古菌进行了嗜盐菌素的筛选及性质分析。抑菌实验发现，在22株不同种属的极端嗜 盐古菌中，有21株可以产生嗜盐菌素【6】。其中由Halobacteriumsp．AS7092产生的HalC8抑 菌谱非常广，可以抑制大多数其它极端嗜盐古菌的生长。理化性质的测定表明，嗜盐菌素HalC8 性质非常稳定，可于100*C煮沸1小时而不失活；一20℃长期冻存不失活；对去盐作用不敏感： 对高浓度蛋白酶K敏感，但对胰蛋白酶不敏感；对大多数有机溶剂如甲醇、乙醇、乙腈等不 敏感。 由于嗜盐菌素HalC8性质稳定且经脱盐处理不失活，我们进而优化了一套嗜盐菌素HalC8 的纯化工艺：收集AS7092稳定期发酵液上清，沸水浴二十分钟，立即置冰上冷却，使不耐热 的蛋白发生变性析出：离心后上清再经3MM滤纸抽滤，进一步清除杂蛋白及细胞碎片；再经 M 切向流过滤浓缩富集5—10