林蛙系统发育的初步研究.pdf

其 他皿581 林蛙系统发育的初步研究 宁方勇 白秀娟 (东北农业大学动物科技学院，哈尔滨，150030) 摘要：为了研究林蛙类之间的系统关系和进化历史，对中国林蛙和黑龙江林蛙18SrRNA基因序列 将该序列发送到Genebank上，其登录号是：AYl45522，AF542043。 关键词：林蛙；系统发育；克隆测序 中国林蛙(Rana chens／nens／s)(David)和黑龙江林蛙(Rana 主要的经济价值在于提供其输卵管，即林蛙油。据《中国药用动物志》(1979，第一卷)、《中华人民共和国 药典》(1985年版)等记载，中国林蛀油有归肺、肾经、退热、，具补肾益精，养阴润肺、补虚等功能。用于 体虚气弱、神经衰弱、病后失调、精神小足、心悸失眠、盗汗不止、痨嗽咳血。治疗和滋补产后亏血和产后 无乳等病症。但是随着分子遗传’7’的发展，许多学者又对不同林蛙的分类学地位从分子水平进行r重 新界定。本研究克隆了中国林蛙和黑龙江林蛙的18S序列，旨在为两栖蛙类的亲缘关系研究和进化历 史提供分子依据。 1材料和方法 1．1 材料 中国林蛙与黑龙江林蛙样品均由方正响河林业局提供。 1．2 PCR引物 (：AATTC佣1AAG一3’。 1．3方法 1．3．1总DNA的提取 称取300rag左右的肌肉组织样品，按照参考文献…的方法提取基因组DNA，提取结果见罔1。 图1巾闰林蛙与黑龙江林蛙基因组电泳结果 左为中国林蛙(1～12)，右为黑』E江林蛙(13～24)，M为Marker 1．3．2PCR扩增 电泳结果表明：中国林蛙除2号样外，其他样品和黑龙江林蛙所有样品的基因组没有降解，可以用 作DNA的PCR扩增，反应体系与循环参数见参考文献_1 J，中国林蛙与黑龙江林蛙扩增后，均产生稳定的 条带，扩增片断长度约为1800bp左右，在U、伊凝胶图像分析系统上的扫描结果见图2。左为中国林蛙 (1—6)，右为黑龙江林蛙(7～9)，空为空白，M为Marker： 间，大约在1800bp左右，是符合要求片断。 582毋皇垦垫塑造堡查壁受塞鲎星 图2中国林蛙与黑龙江林蛙18S扩增结果 1．3．3质粒的酶切鉴定 对PCR产物回收，然后进行连接、转化后进行质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的 PMDl8．T 片段的重组，质粒采用双酶切法鉴定。具体操作如下：根据TaKaRa 产物的阳性克隆(图3)电泳结果表明：所得片断正是要求片断，已经完全切开。 图3质粒的酶切 1为中国林蛙。2为黑龙江林蛀，M为Mark竹。 1．3．4PCR克隆产物的序列测定取20m重组质粒，测序。 2结果 3讨论 对黑龙江两栖类的分子系统学关系，谢锋(1999)等曾用比较分类学和数值分类学相配合的方法进 行过研究，但是这种以形态外貌和生物学特征来粗浅地描述不同的两栖类的差异，存在诸多尖锐的争 议，特别是涉及到种内群体问的来源和差异时，分歧则尤为明显，因此主要依据宏观形态学和染色体学 来分析物种的亲源关系是不够的。由于分子系统学及DNA分子技术的快速发展，使从DNA水平研究 两栖类的亲源关系成为可能。日本学者Tanakaetal(1994，1996)；Tanaka 线粒体12S 从细胞色素b基因序列探讨我国林蛙属动物的系统发生关系。 与黑龙江林蛙的系统关系，结果显示，中国林蛙与黑龙江林蛙仅有两个碱基的差异，在240一300之间有 99．8％。因此作者赞同江建平和周开亚的研究结果，认为中国林蛙和黑龙江林蛙应同属一个物种的同 一科，且所有蛙种中中国林蛙与黑龙江林蛙的亲缘关系最近。 参考文献 [2]江建平，周开亚．中国林蛙的分子系统关系[J]．动物学研究．2