中波紫外线对人永生化表皮细胞株凋亡和死亡的影响.PDF

维普资讯 ll8 ChinaJLeprSkinDis．Feb2O08，Vo1．24，No．2 中波紫外线对人永生化表皮细胞株凋亡和死亡的影响 陈向齐 刘向农 牛高祥 [摘要] 观察不同剂量的中波紫外线(UVB)辐射对体外培养的人角质形成细胞 (HaCaT细胞株)凋亡 和死亡的影响。6O0J／fn2、9OOJ／fn2紫外线照射HaCaT细胞24h后凋亡率、死亡率均明显高于0J／m2 组(对照组)。6O0J／fn2紫外线照射HaCaT细胞4、8、12、24、48、72h后凋亡率明显比对照组高，但4、8h 后死亡率与对照组无显著性差异；12h后死亡率 比对照组高；24、48、72h后死亡率明显比对照组高。 随着紫外线剂量的加大和照射后时间延长，凋亡率和死亡率升高，呈时间和剂量依赖性。 [关键词] 中波紫外线；HaCaT细胞株； 凋亡 由于细胞凋亡与皮肤肿瘤发生的相关性，近年来 孔5Xl04个细胞，每孔终体积为8mL，每个实验组设 紫外线(uV)诱导表皮细胞凋亡引起了人们的关注 。 6个复孔，待细胞长至 90％铺满瓶底时，以PBS液置 细胞坏死时，内容物如酶等的泄漏易对周围组织造成 换培养基，给予不同剂量 0J／m2、300J／m2、6O0J／m2、 损伤。而凋亡时，细胞通过核固缩、膜的改变使其程 9O0J／m2的紫外线照射，照射完成后换为培养基，继续 序性地死亡，并被吞噬细胞所识别和吞噬，内容物无 培养24h后开始操作。将 HaCaT细胞接种于6孔培 外泄，不对组织造成损伤。我们采用膜联蛋 白一V／碘 养板中，每孔 5XlO4个细胞，每孔终体积为8mL，每 化丙啶荧光标记双染色法和流式细胞技术定量分析 个实验组设 6个复孔，待细胞长至 90％铺满瓶底时， 角质形成细胞的早期改变，观察紫外线对HaCaT细胞 以PBS液置换培养基，给予6O0J／m2剂量的紫外线照 凋亡的影响，探讨紫外线照射损伤表皮细胞的机制， 射，照射完成后换为培养基，培养 72、48、24、12、8、4h 为Et晒伤的早期有效防护提供理论依据。 后开始如下操作：用消化液(0．25％胰酶+0．02％ED— 1 材料和方法 TA)在 37~C下完全消化，稀释成单细胞悬液 (细胞数 1．1 主要材料 碘化丙啶 (P1)Coulter；(Annexin—V 应达到 1 个 ／mL)，吸取消化液于5mL离心管，(4~C， 细胞凋亡试剂盒，美国B—D公司产品)；HaCaT细胞 2000r／min，5min)；吸去上清液，加预冷的PBS漂洗 2 株(武汉细胞库)；紫外线灯(上海长兴机械厂，功率 16 次，加0．5mL冰浴的PBS，迅速放于冰上保存(防止细 w，波长为280～320nln，波峰值 302nln)；紫外线强度 胞继续凋亡)；300~L／cm2滤网过滤，去除未完全消化 检测仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；BCM一100型超 细胞团块 ；吸取约0．5mL细胞悬液，加入 5 的An— 净工作台 (苏州市苏净集团)；5％CO2细胞培养箱 nexinV—F兀℃与 2．5 PI混匀；30min内用流式细 NAPCO；EPICSXL流式细胞仪 C0ulter。 胞仪检测。仪器使用前均经过光路和流路的校准， 1．2 方法 将HaCaT细胞接种于6孔培养板中，接 pniT校准、颜色补偿等质控步骤。 种细胞数为 2Xl04个 ／孔，待细胞长至50％～60％铺 结果分析：纵坐标是 AnnexinV—FⅡ℃，横坐标是 Pl，四个象限中，左上象限为早期凋亡细胞，左下象限 满瓶底时，以PBS液(约3mL，下同)置换培养基，置于 为正常细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限代 中波紫外线灯下30cm处，紫外线按0J／m2(未照射)、