显微镜的使用及简单染色法.docVIP

实验一 显微镜的使用及简单染色法 ： 了解显微镜的成像原理油镜加香柏油的原理掌握显微镜的使用掌握简单染色方法初步认识细菌的形态特征油镜的使用方法和无菌操作技术。分辨率（可辨出两点间最小距离） λ为所用光源波长；α为物镜镜口角；n为玻片与物镜间介质的折射率。最短可见光450nm。空气n=1.0；水n=1.33；香柏油n=1.52。光学显微镜在最短波长450nm，用油镜其最大的分辨率为0.18μm。肉眼正常德分辨率为0.25mm。因此光学显微镜有效的最高总放大倍数能达到1000~1500倍。numerical apeature简写为NA是决定物镜性能的最重要指标 镜口角α总是小于180°。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.05-0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4。 2. 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞常带负电荷，而碱性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。染色前必须固定细菌。目的有：一是杀死细菌使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。材料菌种黄色四联球菌12～18h营养琼脂斜面培养物染色剂石炭酸复红染液。仪器或其他用具显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶内装香柏油和二甲苯，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。步骤：?涂片取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴蒸溜水于玻片中央，用接种环以无菌操作斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。注意蒸馏水和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。 2.干燥室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。3.??热固定～4. 染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上染液刚好覆盖涂片薄膜为宜。石炭酸复红20~30秒5.水洗倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。干燥甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。7.??镜检涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。作业： 说明油镜加香柏油的原理。 在染色过程中加热固定的目的是什么？ 绘出四联球菌形态图，并注明菌名、颜色、放大倍数。 2