分子生物實验.doc

分子生物实验 一、名词解释（5×3’） 1.Plasmid:质粒，是细菌染色体外的遗传物质，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。Recombinant DNA:DNA重组：就是采用人工手段将不同来源的DNA片段进行重组，以达到改变生物基因型和获得特定基因产物的目的的一种生物技术。简言之，外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组。 4.Blue-white screening:蓝白斑筛选：重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。MCS, 是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列含有重组DNA分子的转化细胞’） 1.在大肠杆菌感受态细胞的制备实验中，第6步加入Calc2的目的是：洗净前一步残留的LB液体，Calc2的目的是：保存细胞，使其处于感受态。 2.质粒DNA的提取实验的原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。 3.琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验中，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 4.Loading-buffer的中文名称是上样缓冲液。 5.dNTP是dATP、dGTP、dCTP、dTTP的统称。 6.酵母转化的方法主要有三种，分别是醋酸锂转化法、原生质体转化法和电转化法（粒子轰击转化法），其中醋酸锂的作用是其中的Li+可以中和DNA和细胞膜脂所带的负电荷，同时它还可以在细胞膜上形成小的弘道，以便于DNA分子进入细胞，聚乙二醇的作用是能增加细胞膜的聚集，促进DNA分子粘附在细胞表面，增强转化率。 7.在大肠杆菌感受态细胞的制备实验中，我们使用的大肠杆菌种名为：DH5α。 8.在质粒DNA的提取实验中，Tris饱和酚、氯仿、异戊醇三种成分的作用分别是使蛋白质变性，同时抑制了 DNase 的降解作用加速有机相与液相分层可以降低表面张力，从而减少气泡产生有助于分相三磷酸碱基脱氧核苷酸三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸’） 1.简述SDS电泳技术检测蛋白质实验步骤？ ①把玻璃板洗净后用蒸馏水冲洗，晾干，准备2个干净的小烧杯。 ②把玻璃板在灌胶支架上固定好。 ③配置12%分离胶。 ④按比例配好分离胶，用移液枪快速将分离胶加到玻璃板缝隙中，距短板上沿约2cm加少量蒸馏水，静置至胶凝固30min。 ⑤用滤纸把上层的水吸干，按比例配浓缩液，沿边缘连续平稳加入至离短板5mm处，迅速插入梳子，静置到胶凝固，梳子需一次拔出，梳口处不得有气泡，梳底需水平。 ⑥在内槽中加入电泳缓冲液，将内槽置于外槽内，外槽也加电泳buffer。 ⑦上样：将各时间段的样分别取10μl加到样孔中，上样时记清顺序。 ⑧接通电源：80V恒温电泳至溴酚蓝注入分离胶，再用160V至溴酚蓝距下边0.5-1cm停止电泳。 ⑨撬开玻璃板，剥胶。注意分离胶要完整，做好标记后放至有考马斯亮蓝的培养皿中染2h后，用脱色液脱色（期间更换脱色液2-3次），直到蛋白质条带清晰，观察结果并拍照保存。 2.酵母表达载体与一般的细菌表达载体有哪些相同点和不同点？ 相同点：要经过目的基因的获取，目的DNA片段的扩增，载体与目的DNA片段的连接，连接产物的转化和转化后重组子的鉴定。 不同点：酵母表达载体多为穿梭质粒载体，并且目的基因DNA片段与T4载体连接、转化、鉴定后再用酶切目的DNA（5wbp）连接，再用PGBK7EKQ载体连接、转化、筛选、鉴定；用于筛选标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类。 一般细菌表达载体的载体不是穿梭质粒载体，并且目的基因DNA片段只需一种载体即可鉴定筛选，一般用蓝白斑筛选原理，比如在羧苄青霉-gal、IPTG的选择平板上，涂布进行筛选。 3.简述质粒DNA提取实验中，溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用？ 溶液Ⅰ：其中的葡萄糖能够悬浮大肠杆菌、Tris-HCl缓冲液能控制溶液的pH值、EDTA螯合大肠杆菌中的金属离子。 溶液Ⅱ：其中的NaOH碱裂解大肠杆菌的细胞膜，2%SDS是沉淀剂。 溶液Ⅲ：其中的乙酸钾作用是使沉淀能力更强，冰醋酸是中和多余的氢氧化钠。 4.简述琼脂糖凝胶电泳检测DNA的步骤？ 1.?将有机玻璃内槽洗净晾干，放置于水平制胶器内，并