分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(6-2)合编.ppt

PCR操作人员规则（1） 为了预防污染的产生，??进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。????（一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：????1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；????2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；????3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。????各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。????切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。????（二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：????1． PCR用水应为高压灭菌的双蒸水；????2． 引物和dNTP用高压灭菌的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；????3． 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 PCR操作人员规则（2） ????(三) 实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：????1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；????2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；????3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；????4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；????5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；????6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；????7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；????8. 重复实验，验证结果，慎下结论。 污染源的寻找和追踪 ????如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。????（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。????（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有：????1. 模板提取时真空抽干装置；????2. 凝胶电泳加样器；????3. 电泳装置；????4. 紫外分析仪；????5. 切胶用刀或手术刀片；????6. 离心机；????7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等； 此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。????8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。 PCR溶液和设备污染后的处理 （一）环境污染：?? 1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；?2. 紫外照射（UV）法：紫外波长