N3DNA之限制分析.pdfVIP

Restriction-enzyme analysis of DNA N3 DNA 之限制分析 王 愛 玉 限制內切 (restriction endonuclease ，以下簡稱限制) 為一種對DNA 序列具專一 性的核酸分解酵素 (nuclease) ，是分子生物及生物技術上的重要工具。在這個實驗 中 ，我們是以細菌質體 DNA 為材料 ，來練習限制的使用 ，並且以限制來檢定 N2 之PCR 產物是否為lacZ 基因片段。本實驗另一個目的是藉由限制作用後的膠 體電泳分析，學習如何由泳動率來估計DNA 大小，以及體認不同分子量、不同構形 的DNA 在膠體電泳的泳動差異 。 3.1 背景知識 3.1.1 限制 a) 限制的生理功能 ：細菌中存在一種restriction-modification 系統 ，在防禦嗜菌 體上扮演關鍵角色，限制 與DNAmethylase 是這個系統中的兩個主角，前者 可以辨認DNA 上特定的序列 ，並進行phosphodiester linkage 的水解 ，後者則 對限制辨認的序列進行甲基化 (methylation) 修飾 ，一但序列上有甲基化修 飾 ，限制即無法對其作用 。DNA methylase 可對細菌染色體DNA 上的序列 進行甲基化修飾 ，保護染色體DNA 不會受到細菌自己的限制水解 ，但入侵 的噬菌體DNA 由於不具有甲基化修飾或甲基化修飾形式不同 ，細菌的限制 可將之水解 ，限制其複製與增殖 。 b) 限制 的種類：目前分離出之限制主要可分為Type I 、Type II 及Type III 三 大類 。 1) Type I 及Type III ：通常是由數個次單元體組成 ，同時具有endonuclease 及 methylase 的活性。這兩類酵素對phoshodiester bond 水解的位置 （以下簡稱 為切位）與辨識的序列不同 ，Type I 酵素需要ATP 的參與以使酵素由辨識 區移動到距離1 ~ 10kb 之處作用 ，Type III 酵素則不需要ATP 參與反應 ， 其辨識序列與切位通常相距100 bp 以內 。 2) Type II ：這類酵素僅具有endonuclease 活性 ，不具methylation 的作用。大部 分的Type II 限制對DNA 之切位就在辨識序列上 ，不需要ATP 參與反 應，但通常需要二價金屬離子Mg2+ 作為cofactor 。三類限制中以此類最具 實際應用價值 。 b) 限制之命名：依據其來源細菌命名，由三至四個英文字母及一個羅馬數字組 成，前三個字母依序為來源細菌屬名的第一個字母及種名的前兩個字母，第四 生物化學實驗 N3-1 DNA 之限制分析 個字母來自菌株 (strain) 名，羅馬數字則代表在同一菌種中被發現的順序。例 如 ，EcoRI: E = genus Escherichia co = species coli R = strain RY13 I = first endonuclease identified BglII ：