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高效液相色谱1．高效液相色谱法的特点 特点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 . 高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）；(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；(6)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。?高效液相色谱的定性和定量分析的方法 定性：利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。 利用文献保留值定性 相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。 定量：有归一法、内标法、外标法 在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。 ．选择流动相时应注意的几个问题 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。．影响分离的因素与提高柱效的途径 ）．液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径，降低固定相粒度可提高柱效。 2）．液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；（恒温） 3）．改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。1．气相色谱法常用的几种定量分析方法 （1）归一化法：若试样中含有N个组分,且各组分均能洗出色谱峰,则其中某个组分i的质量分数可按下式计算：? 分别为组分i和内标物S的质量校正因子 Ai、AS分别为组分i和内标物S的峰面积 特点及要求：????? 归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。 （2）外标法,外标法也称为标准曲线法。是在一定条件下，测定一系列不同浓度的标准试样的峰面积，绘出峰面积A对质量分数的标准曲线,在严格相同的操作条件下,测定试样中待测组分的峰面积,同测得的峰面积在标准曲线上查出被测组分的质量分数。 特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较高；操作条件变化对结果准确性影响较大；对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。 （3）内标法 内标法是在一定量试样中加入一定量的内标物，根据待测物组分和内标物的峰面积及内标物质量计算待测组分质量的方法。特点：内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大；每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析?内标物要满足以下要求： （a）试样中不含有该物质；（b）与被测组分性质比较接近； （c）不与试样发生化学反应d）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。．色谱柱及柱温 ?填充柱：3米长，直径3毫米。柱温Tc↑ K↓ ?毛细管柱：30～100米长，直径0.5毫米。 选择Tc 的原则：在使组分尽可能分离的条件下使用低温。 Tc不能超过固定相的使用温度和组分的分解温度。组分性质相差大的采用程序升温，否则采取恒温。 ．气相色谱法特点：灵敏度高?? 10-11 ～ -10-15g 分离效率高（异构体、同系物）适合多组分同步分析?样品用量少μg ng）. 进样器有气化作用，温度＜350°，不能测沸点高于350的样品。 .载气的要求：纯度要高，干燥，不能与未知样反应（H2，N2，He）。载气流入要恒压、恒速。 ．最大的允许进样量，控制在峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。 进样时间：越快越好。 ．气化温度：大于沸点，但要低于分解温度。一般选择气化温度比柱温高30—70度。使液体试样迅速气化后被载气带入柱内。归一法具