革兰染色法重点.ppt

革兰染色法 临床病原生物学教研室 前言 近年来，微生物学检验技术发展很快，出现了许多新 的检验方法和技术，比如半自动和全自动微生物鉴定系 统，但微生物的鉴定和分类仍然离不开传统的手工鉴定 方法。如，痰标本在分离培养时所接种的血琼脂平板 麦康凯 及沙氏培养基，在鉴定时我们首先观察培养基上 细菌的菌落特征，如颜色 、气味 、湿润度 、有无溶血 等，我们用什么方法对细菌进行进一步的分类与鉴定 呢？在细菌学最常用的就是革兰染色法。 革兰染色原理 革兰阳性菌 ⑴细胞壁结构致密（肽聚糖层厚），脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。 ⑵等电点低 （pI2~3)； ⑶ 细胞质内含有大量的 核糖核酸镁盐，与结晶紫 和碘牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱去。 革兰阴性菌 ⑴细胞壁结构疏松（肽聚糖层薄)，脂质含量多，乙 醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。 ⑵等电点高（pI4~5)； ⑶ 细胞质内含有少量的核 糖核酸镁盐，吸附染料 少，易被乙醇脱色。 实验目的 1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。 实验器材和试剂 1.标本： 葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂： 结晶紫、卢戈碘液、95％乙醇、稀释石炭酸复红。 3.其他： 载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。 操作步骤 1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大 肠杆菌 培养物少许（取生长在3区的单个菌落），在生 理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径1cm2左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰16cm高处缓慢，烘干，切不可放在火焰上烧干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。 快速染液的步骤 1.加龙胆紫夜染色10秒，水洗，甩干；（龙胆紫，乙醇） 2.加碘溶液染色10秒，水洗，甩干；（碘，碘化钾） 3.加脱色液脱色（10-20）秒，水洗，甩干；（丙酮，乙醇） 4.加沙黄溶液复染10秒，水洗；（沙黄，乙醇） 5.以滤纸吸干标本或在空气中自然干燥后，镜检。 使用快速染液的注意事项 1.妇科白带需延长时间； 2.用完后，请迅速盖好，以免挥发； 3.室温低时，染色时间适当延长； 4.不与其它物品混淆。 操作步骤 2.革兰染色 ⑴初染：将结晶紫加于制好的涂片上，染色1min，用细 流水冲洗，甩去积水。 ⑵媒染：加卢戈碘液作用1min，用细流水冲洗，甩去积 水。 ⑶脱色：滴加95％乙醇数滴，摇动玻片，使均匀脱色 （15~30S)，用细流水冲洗，甩去积水。 ⑷复染：加稀释石炭酸复红30S，用细流水冲洗，甩 去积水。 染色结果观察 影响染色因素 ⑴操作因素：涂片太薄或太厚，固定时菌体过分受热以 及脱色时间长短，都会影响染色结果。 ⑵染液因素：所有染液应防止染液蒸发，特别是卢戈碘 液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片积水过多改变 浓度，影响染色效果，如脱色用的乙醇以95％为宜，浓 度降低会增强其脱色能力。 ⑶细菌因素：一般以18~24小时的培养物染色效果最好。 临床意义 1.通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可 初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。 2.革兰染色除用以鉴定细菌外，病原菌染色特性可为临床 选择用药提供了参考，可以帮助临床制定有针对性治疗方 案。 * * 染色结果观察 *