暨南大学基因工程原理(DNA-蛋白质)讲解.ppt

以DREB 转录因子基因(cDNA) 的克隆为例,介绍如何应用酵母单杂交方法来获得编码特定转录因子的cDNA ,并验证它与特定的顺式作用元件的结合。 1.cDNA AD 融合表达文库( cDNA AD fusion library) 的构建 应用酵母单杂交方法筛选编码特定转录因子的cDNA ,首先要构建cDNA AD 融合表达文库。AD 是激活区(activation domain) 的简写,一般常用GAL4 因子。为了有效地克隆某些特定的转录因子,如在干旱或低温胁迫下调控植物相关耐性基因表达的转录因子,可将植物进行适当的干旱或低温处理,再提取mRNA。这样获得的mRNA 里,编码目的转录因子的基因的含量可以提高几倍至几百倍。对于某些正常情况下不表达的基因,必须经过一些特定处理诱导其表达,才有可能克隆到它们所编码的转录因子。 将分离提纯的mRNA 合成cDNA ,两端接上带有合适酶切位点的连接物(adaptor) ,构建到融合表达载体中GAL4 AD 下游的多克隆位点(图2A) 。然后,进行噬菌体包装(packaging) ,在XL21 细胞内进行自动剪接环化,最后提取cDNA质粒用于筛选。 2 　酵母报道子(Yeast reporter) 的构建 - 顺式元件- Pmin -报道基因- 　　2.1顺式元件重复序列的构建 　　为了提高筛选的效率(即转录因子与顺式元件的识别率),需要在Pmin启动子上游构建3个或3个以上的顺式元件的重复序列。图2B列出的4个DRE元件重复序列的连接方法如下:合成两个DNA引物,末端设计有HindⅢ酶切位点,通过PCR,从rd29A基因的启动子中合成含有一个DRE元件的75bp的DNA片段(在顺式元件上游留出约50bp的碱基,这段序列有助于转录因子与顺式元件的结合)。用HindⅢ限制性内切酶处理75bp的DNA片段,使其两末端露出HindⅢ的连接位点。该DNA片段的序列如下(划线部分为DRE元件): 5′2AGCT2TACATCAGTTTGAAAGAAAAGGGAAAAAAAGAAAAAAT2AAATAAAAGATATACTACCGACATGAGTTCCAAAAA2GCA23′。用T4连接酶连接上述DNA片段。连接反应是随机的,大部分只连接成两个DRE重复的片段,即2DRE2DRE2,少数可以连接成三个DRE重复的片段2DRE2DRE2DRE2或四个DRE重复的片段2DRE2DRE2DRE2DRE2(机率约为2%)。将连接后的DRE重复片段构建插入pBluescriptSK+ 载体的HindⅢ位点,通过测序确定含有4个DRE重复片段及其5′末端和3′末端方向的一致性后,用EcoRⅠ和HincⅡ酶将4个DRE重复片段从pBluescriptSK+载体上切除,得到这样的DNA片段:5′2GAATTC2DRE2DRE2DRE2DRE2GTCGAC23′(5′端为EcoRⅠ位点,3′端为HincⅡ位点)。 2.2?表达载体的构建 　　酵母单杂交中报道子的构建,可采用pHISi21和pLacZi表达载体.pHISi21载体含有最基本启动子PminHIS3和组氨酸报道基因HIS3,在PminHIS3上游插入顺式元件并转化入酵母后,一旦目的转录因子结合到顺式元件,激活PminHIS3启动子,就能促使HIS基因转录表达,从而使酵母细胞在缺乏组氨酸的SD培养基(SDΠHis-)上能够生长,并产生对32AT(32aminotri2azole,剧毒物)的抗性。pLacZi载体则含有最基本启动子PCYC1和半乳糖苷酶报道基因LacZ,在PCYC1上游插入顺式元件并转化入酵母,当目的转录因子结合到顺式元件,激活PCYC1启动子,促使LacZ基因表达后,在ZΠX2gal溶液作用下,能使酵母细胞呈蓝色反应。同时,pLacZi载体也含有尿嘧啶报道基因URA3,因此,转化后的酵母也能在缺乏尿嘧啶的培养基(SDΠUra-)上生长。 　　将含有4个重复DRE元件的串联序列5′2GAATTC2DRE2DRE2DRE2DRE2GTCGAC23′分别构 建到pHISi21载体的PminHIS3启动子和pLacZi载体PCYC1启动子上游,用XhoⅠ和NcoⅠ内切酶分别将pHISi21载体和pLacZi载体切成线状。先将线状pHISi21载体转化到酵母细胞内,获得能在SDΠHis-培养基上正常生长的酵母转化子。接着以这种酵母转化子为寄主细胞,继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SDΠHis-,Ura-培养基上,选择获得如图2B所示的含有pHISi21和pLac2Zi双重报道子的酵母转化子。 3?.cDNA融合表达文库的筛选 利用含有pHISi21和pLacZi双重报