煤矿土壤中甲烷氧化菌的富集培养及其在生物过滤中的应用.pdf

煤矿土壤中甲烷氧化菌的富集培养 及其在生物过滤中的应用 江皓 韩冰 缑仲轩 邢新会 清华大学化学工程系生物化工研究所，北京，100084 摘要 甲烷氧化菌是甲基氧化菌的一个分支，其独特之处在于能利用甲烷作为唯一的碳源和 能源。甲烷氧化菌在自然界中分布广泛，对于全球碳循环和大气中甲烷积累量的减少起重 要作用。基于这种特性，甲烷氧化菌在缓解温室气体效应、治理煤矿瓦斯爆炸等方面，均 引起人们极大研究兴趣。 作者从河南煤矿取样，分别用甲烷和模拟瓦斯气进行驯化筛选，应用DGGE 检测筛选过 程中的群落变化。经过 4 个月的驯化，作者筛选得到生长快、消耗甲烷能力强、菌群结构 稳定的甲烷氧化菌混合菌剂，并对其生长情况、甲烷消耗能力、甲烷单加氧酶酶活和主要 代谢产物（甲醇、甲醛、甲酸及其他有机酸）的积累情况进行检测。将甲烷氧化菌混合菌 剂添加到作者设计好的生物滤器中后，通入 3%的甲烷，停留时间为 25min，一周后甲烷的 去除率可达98%，显示出较好的应用前景。 后续工作中，可结合先进的分子生物学手段，对将混合菌剂用于环境治理过程中的微 生物群落变化、功能基因等进行跟踪和研究，了解过程机理，更好的指导实际应用。 关键词 甲烷氧化菌 甲烷单加氧酶 生物过滤 甲烷减排 1 课题背景与意义 甲烷氧化菌是甲基氧化菌的一个分支，其独特之处在于能利用甲烷作为唯 一的碳源和能源。甲烷氧化菌在自然界中分布广泛，对于全球碳循环和大气中 甲烷积累量的减少起重要作用。甲烷氧化菌利用甲烷的关键酶是甲烷单加氧酶 （Methane Monooxygenase ，MMO ）。MMO 具有很宽的底物范围，不仅能氧化 甲烷生成甲醇，还能将正构烷烃、酯、环烃、芳香化合物和杂环化合物羟基化； 烯烃环氧化；氧化降解卤代烃（二氯甲烷、乙烯基氯、三氯乙烯、二氯乙烯等）。 甲烷氧化菌独特的 MMO 催化特性，其在生产有用化学物质和降解地下水和土 壤中有机污染物方面的潜在用途，以及减少大气甲烷排放量的重要作用，治理 煤矿瓦斯气体爆炸的应用前景等方面，均引起人们极大研究兴趣。 甲烷氧化菌的代谢途径如图1 所示。在甲烷氧化菌细胞内，MMO 是利用甲 烷的第一个关键酶，MMO 在分子氧的作用下将甲烷氧化为甲醇，甲醇在甲醇脱 氢酶（methanol dehydrogenase ，MDH ）的作用下氧化为甲醛，继而通过丝氨酸 循环（serine pathway ）或戊糖磷酸途径（ribulose monophosphate pathway ）进行 细胞合成，同时在甲醛脱氢酶（formaldehyde dehydrogenase，FADH ）和甲酸脱 氢酶（formate dehydrogenase ，FDH ）的作用下甲醛被进一步氧化成甲酸、CO2 和H O ，并为细胞代谢提供还原性辅酶NADH 。 2 图1 甲烷氧化菌的代谢途径 人们根据甲烷氧化菌吸收甲醛的代谢途径、细胞形态、休眠阶段类型、胞 质内膜精细结构和一些生理特征的不同对甲烷氧化菌进行了分类，如表1 所示， 可分类为属于γ变形杆菌亚门（γ- subdivision of the Proteobacteria ）I 型菌，包括 Methylobacter ，Methylomonas ，Methylosoma ，Methylomicrobium ，Methylococcus ， Methylocaldum ， Methylothermus ， Methylohalobius ， Methylosarcina 和 Methylosphaera 十个属，它们利用戊糖磷酸核酮糖途径同化甲醛，主要含 16-C 脂肪酸，胞内膜成束分布；属于 α 变形杆菌亚门（α- subdivision of the Proteobacteria ）II 型菌，包括 Methylocystis ，Methylosinus ，Methylocapsa 和 Methylocella 四个属，它们同化甲醛的途径是丝氨酸途径，其占优势脂肪酸为18-C 脂肪酸，胞内膜分布于细胞壁的周围。近年来，又陆续发现了丝状甲烷氧化菌 Crenothrix polyspora