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DCs外向迁移与AS退化 DCs外向迁移与AS退化 研究目的和意义 主要研究内容 DC培养流程 DCs鉴定— 表面成熟标记流式检测 儿茶酚胺对DCs迁移和CCR7表达的影响 肾上腺素β1 β2 α受体的作用 肾上腺素对DCs迁移能力的影响 肾上腺素不影响DCs成熟 CCR7与DCs外向迁移 肾上腺素对DCs表面CCR7表达的影响 肾上腺素对DCsCCR7基因表达的影响 肾上腺素能受体的作用  肾上腺素能受体的作用  去甲肾上腺素对DCs迁移能力和CCR7表达影响 去甲肾上腺素对DCs分泌IL10的影响 结 论 树突状细胞MAPK 示意图 MAPK等通路抑制剂对 LPS诱导的DCs 迁移能力改变的影响 肾上腺素对LPS诱导的DCs P38激活的影响 MAPK等通路抑制剂对 LPS诱导的DCs 迁移能力和CCR7表达改变的影响 MAPK等通路抑制剂对 LPS诱导的DCs 迁移能力和CCR7表达改变的影响 其他通路抑制剂对 LPS诱导的DCs 迁移能力和CCR7表达改变的影响 MAPK等通路抑制剂对 LPS诱导的DCs 迁移能力和CCR7表达改变的影响 总 结 结 论 本研究的目的就是通过体外细胞实验初步检验我们的假设，观察儿茶酚胺是否影响人DCs迁移功能和CCR7表达，并探讨其机制。 体外观察儿茶酚胺是否影响人DCs迁移功能和CCR7表达，并探讨其机制。 用密度梯度离心法分离健康成人单个核细胞，分别采用贴壁法和CD14免疫磁珠分选法获得单核细胞，加入重组人IL4和GM-CSF诱导DC分化，第六天加入LPS刺激成熟。分别从细胞形态\DC表面标记\DC成熟标记鉴定DC细胞. LPS干预前，先加入不同的通路阻滞剂作用1小时，包括：。 儿茶酚胺主要包括肾上腺素和去甲肾上腺素，我们首先观察肾上腺素的作用。结果，LPS诱导DC成熟的同时加入肾上腺素，可以抑制成熟DC的迁移能力。具有一定浓度依赖性，10-5M作用最强， 采用PCR法，从基因水平检测CCR7的表达，结果类似。 提示肾上腺素通过下调CCR7表达,抑制DC迁移。肾上腺素通过哪种受体起作用呢？ 给予不同的AR阻断剂，结果显示各种b可部分阻断肾上腺素对DC迁移能力的影响，B2作用最强，而a受体阻滞剂无此作用。 而加入肾上腺素共同作用，对DC成熟标记的表达无明显影响。 说明肾上腺素对DC迁移能力的抑制，不是通过抑制DC成熟。 肾上腺素通过哪种受体起作用呢？ 给予不同的AR阻断剂，结果显示各种b可部分阻断肾上腺素对DC迁移能力的影响，B2作用最强，而a受体阻滞剂无此作用。 流式显示肾上腺素对DCs CCR7的影响也由β受体介导，其中β2受体阻滞剂作用最强。 提示肾上腺素主要通过β2受体抑制CCR7表达从而抑制DC迁移 ELISA结果显示去甲肾明显促进DC分泌IL10。给予β1或非选择性β受体阻滞剂可以抑制NE对IL10的促进(p0.05)，而β2和α受体阻滞剂无此作用(p0.05)(图7C)。 提示NE主要通过β1受体促进DCs分泌IL10。 另一种儿茶酚胺类神经递质——去甲肾上腺素。不同浓度的去甲均可抑制成熟DCs迁移 本实验在树突状细胞培养第6天，分为6组，分别加入LPS、肾上腺素或去甲肾上腺素，以及LPS同时加入不同浓度的儿茶酚胺，干预24小时； 具体研究内容分3部分 细胞培养第六天加入LPS（200ng/ml）诱导成熟，48小时后流式细胞仪检测发现LPS组细胞与空白对照组相比，DC表面成熟标记CD86、 HLA-DR显著上调。 在研究肾上腺素能受体作用的实验中，加入儿茶酚胺之前，分别加入b1b2ba受体阻滞剂作用30分钟。 采用流式双标，以树突状细胞标记CD11c阳性的细胞设门，图中数值表示CCR7阳性细胞百分比。 结果肾上腺素能抑制成熟DC CCR7的表达， 10-5M作用最强，降低17.09%。 目前认为MAPK信号通路是DCs表型和包括迁移能力在内的功能改变的重要信号通路，不同的MARK通路可能参与DCs不同表型和功能的调节。 另外有研究报道NFKB和AKT通路在DC成熟和迁移中的作用。本研究肾上腺素抑制DC迁移能力的信号通路。 LPS，加或不加肾上腺素肾上腺素对LPS激活通路蛋白的影响。 在LPS刺激前预先给予P38 MAPK 抑制剂，可以抑制由LPS诱导成熟的DCs向MIP-3β的迁移能力, Erk和Jnk抑制剂则无此作用。 LPS刺激磷酸化p38-MAPK表达，在10分钟时可以看到表达增加（P0.01），40min达到高峰（P0.01），以后开始下降（图2A）。 * 第二军医大学附属长征医院心内科 Epinephrine impairs Human Mono