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第五章 农药残留测定方法 二、流动相的基本要求 保持色谱柱的稳定性，因而与固定相不互溶（延长柱寿命） 不发生不可逆吸附 有合适的pH值 化学惰性—不与样品及固定相发生反应。 UV：在紫外线区“透明” 示差：折射率与溶剂有较大差异 电化学检测器：电惰性。 对样品有很强的溶解力。 清洗与更换方便 低价、毒性小、纯度高。 2. 流动相的选择 有合适的理化性质（沸点、粘度等，尽可能小一些） 合适的强度（分配系数要合适，简单样品可大，复杂样品要小） 混合溶剂（有等度和梯度之分） 极性合适（需根据溶剂的性质而定） 3、 流动相的物理参数 溶解度参数（溶剂极性的量度）：与样品分配比有关，要适中。 沸点：要低些，便于回收分离样品。 粘度：柱效与粘度成反比，要求早在0.4～0.5cP。 混合溶剂一般能降低粘度。 4、 混合溶剂 可靠改变溶剂组成来调节溶剂的强度等，以适合不容的样品。 等度淋洗：淋洗过程中溶剂组成不变，强度恒定，k值在10以内可得较好的分离。 梯度淋洗：淋洗过程中溶剂组成随时间而变，一般使强度按程序增加，使组分在最合适的k值处洗出。 5、梯度淋洗 使用于极性范围宽的混合物的分离。 优点： 提供限单位时间内的最大分离度。 提高出峰的对称性 减小峰宽 降低检测 5、梯度淋洗 问题： 要用高纯试剂（贵）。 可能在固定相上产生杂质富集，需再生处理（尤其是极性柱），可用10 ～ 30倍柱体积的溶剂淋洗。 （一）、防止堵塞 （一）、防止堵塞 （一）、防止堵塞 5．要防止反冲（流动相逆向流动），否则使固定相层位移，柱效下降。 6．柱子两端用金属螺帽封闭，保存在纯净的有机溶剂中。应该将柱子保存在以下pH范围内的水溶液流动相中：2pH8.5。为了长期保存，最好用纯有机溶剂（如甲醇）清洗柱子。 7．一定要防止柱子干涸，特别是硬胶柱。 二、液相色谱柱的保养 8．使用卫柱(Guard Column,亦称预柱)。连续注射含有强滞留(不被洗脱)组分的样品，将使柱效下降，保留值改变，选择性变坏，柱寿命缩短。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱之间加上卫柱。 二、液相色谱柱的保养 卫柱较短(5~10cm)，固定相与分析柱类似。其作用是吸着强滞留的组分，防止对分析柱的污染，保持分析柱性能稳定。实验表明，只要卫柱与高效、小粒度分析柱联用，除了使k’为零的组分的塔板数大大减少外，对k’值较大的组分，其柱效下降很少。 色谱峰的测量 重叠峰在测量上有困难，可用计算机方法进行拟合 复习思考题 本节首页 退出本章 步骤3：断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压 （1） 若压力稳定下降，至步骤4 （2） 若压力不下降，至步骤5 步骤4：保持色谱柱反方向连接，用低于0.5 ml/min 流速 冲洗1 小时若步骤4 不能降压，至步骤5 6、柱堵塞的修复 本节首页 退出本章 步骤5：若内置过滤器被堵塞，应冲洗或更换。柱连接端的拆卸或重装会导致柱效下降（有效塔板数下降和不对称峰）若步骤5 不能降低柱压，至步骤6 步骤6：若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。（2~5mm） 6、柱堵塞的修复 五、FL2200型 液相色谱仪 1、高压输液泵 2、高压进样阀 3、液相色谱柱 4、紫外检测器 5、溶剂箱 1、高压输液泵输液系统 2、高压输液泵 样品完全溶解在流动相中 样品没有完全溶解 过滤样品，不含固体颗粒 用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品 进样量尽量小 六、常见峰问题 1、样品制备 2、峰形问题（双峰） 柱头塌陷或柱床运动。 泵头过滤芯(Frit)部分堵塞。 组份共流出 正 常 双 峰 柱头塌陷 问题： 一个有紫外吸收的流动相与一个没有紫外吸收的流动相动态混合产生噪音，增加静态混合器可以降低这种噪音。 缺点: 增加了延迟体积 静态混合器 3、噪 音 检测池脏 检测池灯能量下降 由泵引起的脉冲 检测器上的温度效应 检测池中有气泡通过 Time (min.) 4、基线噪音 5、基线漂移 梯度洗脱引起的 温度不稳定（RID） 流动相脏 柱子没有用流动相平衡 系统中污染物溢出 6、鬼 峰 20% ～100% MeOH梯度洗脱，没有进样 鬼峰：没有进样就有色谱峰出现。 原因－流动相脏 7、柱外扩展 用较短的、窄内径的毛细管连接进样器和色谱柱以及柱子和检测器。 确认连接管的接头都相互匹配。 使用死体积小的流动池 减小进样量 增加柱外死体积 8、峰扩展 所有峰都扩展 柱效降低或有柱塌陷 进样体积过大 流动相粘度大 部分峰扩展 前一次分析样品的流出物 高分子量样品－蛋白质或聚合物 拖尾因子 A B Excellent t = 1.0 - 1.05 Acceptable