八章基因诊断GeneDiagnosis.pptVIP

* Southern印迹杂交是经典的DNA分析方法。将DNA经限制性酶切及变性后，转移至膜上与标记探针进行杂交。主要用于基因组DNA的分析--检测特异的DNA片段并进行定位和测定相对分子质量；也可有用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等； * PCR又称为基因扩增技术，通过采用特异性引物扩增特异DNA片段，具有周期短、特异性强、灵敏度高、操作简便、快速以及对原始DNA样品的数量和质量要求低等特点，极大地推动了基因诊断的发展，在基因诊断中已得到了广泛应用。 * 特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术 ——应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。 * DNA测序是基因诊断中最直接、最准确的方法，通过直接分析待测基因的碱基排列顺序检测基因的突变并确定突变的部位、性质。由于自动测序技术的发展及商业化，DNA测序有望应用于临床。 βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 突变探针 1、Gene 缺失遗传病的诊断 1）α地贫的Gene诊断 α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个α Gene时可得到10kb片段。 BamHI BamHI α2 α1 α2 10 kb 14 kb probe 以αGene为探针，Southern blot 方法检测 αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺4 14kb 10kb 直接诊断：检测已知致病基因 在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等 2.基因重排\缺失 ：核酸分子探针杂交与PCR （1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号 （2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座 直接诊断：检测已知致病基因 杜氏肌营养不良症的基因诊断 DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。 病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。Gene 定位Xp21 ， Gene 2300kb,79 个Exon ，cDNA全长13974bp，编码3685 Aa，分子量427kD。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%。 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 4. 胎儿 5. 阴性对照 4. 胎儿 5. 阴性对照 采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子 3. 基因表达异常 mRNA的相对定量分析 mRNA长度分析 直接诊断：检测已知致病基因 二、遗传病间接诊断 当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和遗传标记的连锁分析间接地作出诊断。 连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁， 通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断。 遗传标记（限制性片段长度多态性、微卫星DNA序列、单核苷酸多态性等） 1 Southern blot--RFLP诊断(PKU) PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。 间接基因诊断 患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁 其父、母亲缺陷的PAH