六章沉淀反应.pptVIP

第六章 沉淀反应 第一节 沉淀反应的特点 第二节　液体内沉淀试验 一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定 第三节　凝胶内沉淀试验 一、单向扩散试验 二、双向扩散试验 第四节 免疫电泳技术 一、对流免疫电泳 二、火箭免疫电泳 三、免疫电泳 四、免疫固定电泳 第一节 沉淀反应原理及特点 第二节　液体内沉淀试验 表6-1 最适比方阵测定法 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。 1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力　　　　　　　强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法 第三节　凝胶内沉淀试验 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。 影响因素： 抗体质量 标准曲线 ，质控血清 结果与真实含量不符 　单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高 双环现象 　不同扩散率抗原性相同的两个组分 第四节　免疫电泳技术 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　 结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。 1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。 分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。 1.主要用于血液、体液中蛋白质的测定。 2.优点：稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量标本检测。3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘故已不推荐使用。 4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分析。 5.免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分析，常用于M蛋白的鉴定与分型。 1.什么是沉淀反应？ 2.沉淀反应的特点？ 3.免疫浊度法的原理、方法与分类？ 4.单向扩散试验的原理和应用？ 5.免疫固定电泳的原理及临床应用价值？ 6.何谓Mancini曲线？ 7.何谓Fahey曲线？ 8.影响免疫比浊测定的因素有哪些？ 9.抗原性质分析出现哪三种结果现象？结果解释？ 10.自动化免疫比浊法发展趋势和应用前景？ 沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出的沉淀现象.根据沉淀反应介质和检测方法的不同，将其分为液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。 免疫浊法度测定为液体内沉淀试验；单向扩散试验平板法是一种定量的凝胶内沉淀试验，免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。 影响因素 火箭免疫电泳 　　　　火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本 - + 火箭免疫电泳示意图 原理：区带电泳＋双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。 技术要点：制备琼脂板 打孔，加样于孔内，电泳2～3mA/cm ，0.5～1h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。 三、免疫电泳 纯化抗原和抗体成分的分析及正常和 异常免疫球蛋白的识别与鉴定 影响因素 抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比 抗血清的的抗体谱 ，混合抗血清的使用 　　电泳条件直接影响分辨率 应　用 免疫电泳 - + 免疫电泳示意图 免疫电泳原理，不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型 　 原理 区带电泳＋沉淀反应 四、免疫固定电泳 先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相应M蛋白成分。 技术要点 免疫固定电泳 　左图为IgG κ型, 中图为IgG λ型，右为正常 SP G A M κ λ